環(huán)狀RNA在肝纖維化中的作用機(jī)制研究進(jìn)展

葉志榮，林暉，繆輝來

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科，廣東 湛江 524023)

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA/circ)是一類由外顯子或外顯子-內(nèi)含子經(jīng)共價(jià)鍵連接而成的環(huán)形非編碼RNA，最初被認(rèn)為是錯(cuò)誤剪輯的廢棄產(chǎn)物，隨著對非編碼RNA研究的深入，circRNA的生物學(xué)功能也逐漸被發(fā)掘。由于circRNA沒有5′端帽子和3′端poly(A)尾巴，其序列高度保守，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；此外，circRNA可充當(dāng)微RNA(microRNA，miRNA/miR)的分子海綿，競爭性抑制miRNA，從而調(diào)控下游基因和蛋白的表達(dá)，這些特征及生物學(xué)功能使circRNA成為繼小核RNA(small nuclear RNA，snRNA)、miRNA和長鏈非編碼RNA(long non-cording RNA，lncRNA) 之后的又一研究熱點(diǎn)[1]。目前關(guān)于circRNA的研究主要集中于生物標(biāo)志物和miRNA海綿調(diào)控作用，但隨著對circRNA研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)等特定條件下可翻譯蛋白并發(fā)揮細(xì)胞調(diào)節(jié)功能，這一發(fā)現(xiàn)顛覆了人們對circRNA是非編碼RNA的認(rèn)知，為circRNA的研究開辟了新方向[2]。肝纖維化是肝損傷常見的病理轉(zhuǎn)歸，但肝纖維化的修復(fù)及逆轉(zhuǎn)機(jī)制目前尚不明確。有證據(jù)表明，circRNA與肝纖維化等相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]?，F(xiàn)就circRNA在肝纖維化中作用機(jī)制的研究進(jìn)展予以綜述。

1 circRNA的生物學(xué)功能

1.1翻譯蛋白 Abe等[2]參考聚合酶鏈反應(yīng)的滾動(dòng)擴(kuò)增技術(shù)，將含有無限開放閱讀框的circRNA在無細(xì)胞的大腸埃希菌翻譯系統(tǒng)中成功翻譯成蛋白質(zhì)。為了證明細(xì)胞中circRNA的翻譯功能，研究者合成了含有標(biāo)簽序列的circRNA，并分別轉(zhuǎn)染至兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)和HeLa細(xì)胞系中，通過免疫熒光染色及蛋白質(zhì)印跡法檢測證實(shí)，在活細(xì)胞內(nèi)即使無內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列、polyA尾或帽結(jié)構(gòu)，circRNA分子仍可順利翻譯成蛋白質(zhì)并發(fā)揮功能[4]。circRNA翻譯功能的發(fā)現(xiàn)為circRNA研究提供了新的思路。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA含F(xiàn)-框WD重復(fù)域蛋白7基因編碼一個(gè)新蛋白含F(xiàn)-框WD重復(fù)域蛋白7-185aa，可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖[5]；肝癌細(xì)胞中的circRNA β聯(lián)蛋白(β-catenin)翻譯產(chǎn)生一種同工型蛋白β-catenin-370aa，可激活Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長[6]。

1.2作為miRNA海綿 與線性RNA相比，circRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性更好，可在人體血液、唾液等體液中分泌表達(dá)，并在不同位置表現(xiàn)出特異性。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA含有許多miRNA結(jié)合位點(diǎn)，因此可阻斷或降低miRNA抑制基因的作用，這種抑制作用是指circRNA通過其種子序列與信使RNA的3′非翻譯區(qū)以堿基配對的形式結(jié)合，進(jìn)而抑制信使RNA翻譯或促進(jìn)信使RNA降解[7-8]。RNA的海綿作用是指circRNA作為競爭性內(nèi)源RNA對靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。circRNA與堿基互補(bǔ)配對的miRNA競爭性結(jié)合，以海綿樣吸附作用降低miRNA豐度，同時(shí)抑制其表達(dá)，從而調(diào)控miRNA下游靶基因和蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞的功能及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。在肝癌細(xì)胞中，circRNA同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶3海綿樣結(jié)合miR-124，并通過抑制miR-124豐度上調(diào)水通道蛋白3的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[9]；在二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化疾病中，circRNA小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物作為miR-7海綿競爭性抑制miR-7，并通過下游miR-7/轉(zhuǎn)化生長因子-β2信號通路促進(jìn)肺纖維化的形成[10]；Wang等[11]證實(shí)，circRNA MTO1(mitochondrial tran-slation optimization 1)可通過結(jié)合miR-17-5p上調(diào)Smad7的表達(dá)。另外，mmu_circ_42398可通過結(jié)合miR-338-3p上調(diào)BMP激活素膜結(jié)合抑制因子同源物的表達(dá)，抑制Smads蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β1/Smad信號通路抑制肝纖維化的進(jìn)展[12]。

1.3調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄 有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在基因調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[13]。隨著生物信息和基因測序技術(shù)的發(fā)展，circRNA在基因調(diào)控過程中的作用逐漸明確，相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的大規(guī)模數(shù)據(jù)已成為科研人員研究基因調(diào)控的重要資源和依據(jù)。一些circRNA通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)發(fā)揮生物學(xué)功能。如RNA聚合酶Ⅱ相關(guān)的circRNA真核翻譯起始因子3J和circRNA多聚腺苷酸結(jié)合蛋白相互作用蛋白2在HeLa細(xì)胞和HEK293細(xì)胞核中作為順式作用元件調(diào)節(jié)其親本基因的表達(dá)；circRNA真核翻譯起始因子3J和circRNA多聚腺苷酸結(jié)合蛋白相互作用蛋白2還可通過與U1 snRNA特異性RNA-RNA相互作用生成U1 snRNA復(fù)合物，然后cirRNA cRNA-U1 snRNA復(fù)合物在親本基因啟動(dòng)子上進(jìn)一步與RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合，達(dá)到刺激轉(zhuǎn)錄和增強(qiáng)基因表達(dá)的目的[14]。

1.4調(diào)節(jié)蛋白功能 除了調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，circRNA還可作為適配器調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用和蛋白的活性。Du等[15]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3(forkhead box O transcription factor 3，F(xiàn)oxO3)在小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞系和黑色素瘤B16細(xì)胞系中均特異性低表達(dá)，并作為適配器連接細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21，通過形成circRNA Foxo3-p21-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2三元復(fù)合物抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2的功能，從而延緩細(xì)胞周期進(jìn)程。此外，circRNA FoxO3還可同時(shí)結(jié)合p53和鼠雙微體2基因，在鼠雙微體2基因調(diào)節(jié)p53的多聚泛素化功能中起雙重調(diào)節(jié)作用，過表達(dá)circRNA FoxO3可顯著抑制鼠雙微體2基因多聚泛素化功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。

2 circRNA在肝纖維化中的作用

2.1circRNA與肝纖維化形成機(jī)制 circRNA是非編碼RNA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，在揭示疾病發(fā)病機(jī)制、探究診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)等方面均取得了一定進(jìn)展[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA與原發(fā)性肝癌、脂肪肝等慢性肝臟疾病相關(guān)[18]。有研究指出，可將circRNA作為診斷原發(fā)性肝癌的主要標(biāo)志物之一[19]。另外，circRNA還與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[18]，但關(guān)于其具體機(jī)制的研究較少。肝纖維化是肝臟損傷和修復(fù)過程中產(chǎn)生的病理現(xiàn)象。肝纖維化主要由細(xì)胞外基質(zhì)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白過量沉積導(dǎo)致，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)在損傷的刺激下轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源。因此，HSC的激活是肝纖維化的必要條件，HSC也是目前公認(rèn)的肝纖維化關(guān)鍵細(xì)胞[20]。激活的HSC可分泌成纖維細(xì)胞生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)肝纖維化進(jìn)程[21]，并釋放富含circRNA等信號分子的細(xì)胞外囊泡，調(diào)節(jié)鄰近的肝細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，甚至驅(qū)動(dòng)靜息狀態(tài)的HSC活化，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[22]。

此外，circRNA還可通過miRNA海綿功能調(diào)控HSC的功能及狀態(tài)，從而介導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)程。Zhu等[23]報(bào)道，胸腺素β4通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路在HSC中發(fā)揮抗肝纖維化作用，利用基因芯片檢測胸腺素β4缺失HSC中circRNA的差異表達(dá)發(fā)現(xiàn)，circRNA-0067835顯著上調(diào)，而敲除circRNA-0067835則可顯著抑制HSC的增殖并促進(jìn)其凋亡；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-0067835具有miR-155海綿功能，其可通過競爭性抑制miR-155上調(diào)Foxo3a和蛋白激酶B的表達(dá)，證實(shí)circRNA-0067835可通過miR-155/FoxO3信號通路介導(dǎo)胸腺素β4的抗肝纖維化作用。Ji等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠肝損傷模型和轉(zhuǎn)化生長因子-β1激活的人HSC細(xì)胞模型中hsa_circ_0070963的表達(dá)均顯著下調(diào)，并證實(shí)hsa_circ_0070963作為miR-223-3p海綿可通過miR-223-3p/LEMD3(LAP2-emerin-MAN1 domain-containing protein 3)信號通路抑制HSC的活化，進(jìn)而抑制肝纖維化的發(fā)生。表明circRNA可調(diào)節(jié)肝纖維化關(guān)鍵細(xì)胞HSC的活化與功能，因此可作為抑制HSC活化的治療靶點(diǎn)，促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。

2.2circRNA與各種肝病引起的肝纖維化 肝細(xì)胞纖維化和早期肝硬化均可通過早期干預(yù)逆轉(zhuǎn)，因此盡早治療可顯著降低肝衰竭風(fēng)險(xiǎn)、改善患者預(yù)后[25]。目前肝纖維化的早期診斷存在創(chuàng)傷大、特異性差等問題，因此尋找肝纖維化的特異性標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對肝病治療具有重要意義。2017年，Chen等[26]首次報(bào)道了circRNA與HSC活化有關(guān)，該研究采用基因芯片技術(shù)分析了放射線誘導(dǎo)的人HSC LX-2細(xì)胞活化模型的circRNA差異表達(dá)譜，并證實(shí)hsa_circ_0071410可特異性結(jié)合miR-9-5p，通過miRNA海綿作用影響HSC的活化水平。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)血清circRNA MTO1水平與肝纖維化的進(jìn)展呈顯著負(fù)相關(guān)，且體外HSC細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)一步證實(shí)，circRNA MTO1可通過結(jié)合miR-17-5p上調(diào)Smad7的表達(dá)，從而抑制肝纖維化的進(jìn)展。另外，Zhu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-0067835可通過調(diào)節(jié)miR-155/Foxo3信號通路影響HSC的活化。以上研究均表明，部分circRNA可影響肝纖維化進(jìn)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)——HSC活化，但circRNA與肝纖維化的關(guān)系及具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

2.2.1circRNA與病毒性肝炎 病毒性肝炎是目前我國最常見的肝臟疾病，也是肝纖維化最主要的原因之一。早期病毒性肝炎雖無明顯癥狀，但持續(xù)、輕微的炎癥損傷累積可導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌，目前丙型病毒性肝炎的根治率約90%，而乙型病毒性肝炎尚無根治手段，全球每年約有85萬人死于乙型病毒性肝炎繼發(fā)的肝損傷疾病[27]。Wang等[11]在慢性乙型肝炎患者血清中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的circRNA MTO1，且circRNA MTO1的表達(dá)與纖維化分期及Knodell組織學(xué)活動(dòng)指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合circRNA特性，circRNA MTO1具有成為肝纖維化新診斷標(biāo)志物的潛力；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，circRNA MTO1還參與了轉(zhuǎn)化生長因子-β1激活HSC的過程，并作為miR-17-5p海綿抑制miR-17-5p及下游Smad7的表達(dá)，進(jìn)而抑制慢性乙型肝炎相關(guān)的HSC活化和肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。國外一項(xiàng)研究參照Miravirsen的鎖核酸修飾反義寡核苷酸技術(shù)人工合成了一個(gè)circRNA分子，并將其作為miR-122分子海綿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該circRNA不僅可下調(diào)miR-122的表達(dá)，還可與丙型肝炎病毒增殖所需的宿主因子hnRNP L等結(jié)合，甚至可以與丙型肝炎病毒蛋白結(jié)合，阻斷其增殖和傳播[28]。由此可見，circRNA可能成為各種病毒性肝炎肝纖維化的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

2.2.2circRNA與酒精性肝病 乙醇是化學(xué)性肝損傷的首要因素，酒精性肝病是僅次于病毒性肝炎的第二大肝硬化致病原因。目前針對酒精性肝病的治療方法較少，主要以戒酒和保肝治療為主，對于嚴(yán)重酒精性肝炎患者，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素是目前降低患者病死率的唯一有效療法[29]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，乙醇喂養(yǎng)小鼠肝臟庫普弗細(xì)胞中circ_1639表達(dá)上調(diào)，而過表達(dá)circ_1639可通過miR-122海綿作用調(diào)節(jié)下游人腫瘤壞死因子受體超家族成員13C的表達(dá)，從而激活核因子κB信號通路，而敲低circ_1639表達(dá)則可降低酒精性肝病的炎癥反應(yīng)及纖維化程度，為酒精性肝病及其繼發(fā)的肝纖維化提供新的治療靶點(diǎn)[30]。

2.2.3circRNA與藥物性肝損傷 肝臟是藥物代謝的重要場所，藥物性肝損傷是臨床藥物治療最常見的不良反應(yīng)之一。Shen等[31]對我國308所醫(yī)院25 927例藥物性肝損傷確診患者的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，我國藥物性肝損傷的發(fā)生率較高，其中藥物危害最嚴(yán)重的是傳統(tǒng)中藥制劑和抗結(jié)核藥，其主要通過引起藥物損傷性肝纖維化導(dǎo)致患者因肝硬化和肝衰竭死亡。Li等[32]利用過氧化氫誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-4099與miR-706在受損肝細(xì)胞中相互調(diào)節(jié)，circRNA-4099通過觸發(fā)Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1/核因子E2相關(guān)因子2和p38促分裂原活化的蛋白激酶信號通路抑制miR-706的表達(dá)，從而促進(jìn)過氧化氫誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致肝纖維化。

2.2.4circRNA與放射性肝損傷 放射性肝損傷是肝癌放療的常見并發(fā)癥，也是胸部和上腹部放療最嚴(yán)重的并發(fā)癥[33]。放射性肝損傷常伴隨circRNA的異常表達(dá)，表明circRNA可能參與肝細(xì)胞對輻射的反應(yīng)和纖維化過程。circRNA可通過抑制或減弱相關(guān)基因的表達(dá)，減弱輻射誘導(dǎo)的HSC活化，輻射損傷主要通過刺激HSC活化引起纖維化物質(zhì)及炎癥因子釋放，導(dǎo)致持續(xù)的瘢痕形成和炎癥損傷，從而引起肝纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致肝大和腹水等嚴(yán)重癥狀；另外，在輻射和脂多糖刺激誘導(dǎo)下，人HSC LX-2細(xì)胞中circRNA TUBD1(tubulin delta 1)的表達(dá)顯著升高，而通過小干擾RNA敲除circRNA TUBD1的表達(dá)則可抑制LX-2細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，同時(shí)顯著降低輻射和脂多糖損傷的LX-2細(xì)胞中炎癥因子的水平；circRNA TUBD1還可作為miR-146a-5p海綿，通過Toll樣受體4信號通路調(diào)控HSC的激活，從而參與輻射對肝細(xì)胞的損傷和纖維化過程[34]。Chen等[35]發(fā)現(xiàn)，在輻射損傷的HSC LX-2細(xì)胞中，circRNA重構(gòu)剪切因子1與miR-146a-5p海綿樣結(jié)合，通過增加下游Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1的表達(dá)增強(qiáng)受損LX-2細(xì)胞的活力和肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)炎癥因子和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白釋放，加重肝纖維化。以上研究均表明，circRNA參與調(diào)節(jié)輻射損傷的HSC活化和纖維化物質(zhì)釋放，為放射性肝損傷中肝纖維化的治療提供了新方法。

2.2.5circRNA與非酒精性脂肪性肝炎 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，而非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是NAFLD的關(guān)鍵階段，若治療不及時(shí)可導(dǎo)致肝硬化、終末期肝病與肝細(xì)胞癌[36]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。circRNA與NAFLD及肝再生機(jī)制相關(guān)[37]。在NASH發(fā)病機(jī)制的研究中，研究者首先通過基因芯片技術(shù)檢測小鼠NASH模型，檢測出可同時(shí)促進(jìn)circRNA與抑制信使RNA表達(dá)的miRNA——miR-122，然后利用circRNA、miR-122和信使RNA隨機(jī)組建4組circRNA-miRNA-信使RNA網(wǎng)絡(luò)，最后通過研究4組circRNA-miRNA-信使RNA網(wǎng)絡(luò)對肝損傷的影響，發(fā)現(xiàn)NASH的發(fā)生發(fā)展與circRNA密切相關(guān)，提示circRNA有成為NASH治療靶標(biāo)的潛力[38]。另有研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中醫(yī)強(qiáng)肝藥方可顯著改善NASH患者的癥狀，研究者用強(qiáng)肝藥方提取物喂養(yǎng)小鼠并建造模型，高通量測序結(jié)果表明，小鼠肝臟中的circ_0007379表達(dá)顯著上調(diào)，而circ_004572表達(dá)下調(diào)，可能與強(qiáng)肝藥方治療NASH的機(jī)制相關(guān)[39]。

3 小 結(jié)

肝纖維化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前臨床尚無理想的治療方法。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，circRNA對肝纖維化的調(diào)節(jié)作用不斷被發(fā)現(xiàn)。多種circRNA均參與了肝纖維化關(guān)鍵細(xì)胞HSC的增殖與活化水平的調(diào)節(jié)，并發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能。目前針對circRNA生物學(xué)功能的研究主要集中于miRNA海綿功能，對circRNA的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控蛋白表達(dá)等生物學(xué)功能的研究仍處于起步階段，還有待進(jìn)一步研究闡明。未來，結(jié)合circRNA的特性對肝纖維化發(fā)展過程深入探索，可為肝纖維化的研究提供新方向，且隨著研究的深入，RNA干擾技術(shù)將為肝纖維化的治療提供新思路。