免疫和炎癥中的自噬

耿聰聰，谷變利，孔金玉，張秀森，王立東，王云龍，郭永軍,李恩民，趙遠(yuǎn)錦，高社干

自噬是真核細(xì)胞處理過大而不能被蛋白酶體降解的胞內(nèi)細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集物的唯一已知機(jī)制。因此，這一機(jī)制被稱為自噬的溶酶體降解途徑，也被用來降解入侵細(xì)胞內(nèi)的微生物(如病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物)[1-2]。在多細(xì)胞生物中，自噬途徑或自噬蛋白的獨(dú)特功能在控制免疫的其他不同方面也起著核心作用，這種作用也許不那么明顯，但從目的性上來說是很直觀的。

自噬機(jī)制與大多數(shù)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)途徑相連接，包括那些參與控制免疫反應(yīng)和炎癥的途徑[3]。不僅在自噬途徑的水平上，而且在自噬蛋白和免疫信號(hào)分子之間也有直接的相互作用[4]。自噬途徑/蛋白與免疫和炎癥之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，自噬蛋白在誘導(dǎo)和抑制免疫和炎癥反應(yīng)中起作用，免疫和炎癥信號(hào)在誘導(dǎo)和抑制自噬中起作用。此外，與癌癥、神經(jīng)退行性疾病和年齡增長(zhǎng)相似[5]，自噬缺陷通過自噬基因突變和/或微生物拮抗可能是許多傳染病和炎癥綜合征發(fā)病的基礎(chǔ)。

本文綜述了對(duì)自噬、免疫和炎癥三者之間的不同交叉反應(yīng)的最新研究進(jìn)展，并對(duì)自噬在食管相關(guān)疾病中的作用進(jìn)行了闡述。

1 自噬的機(jī)制和膜動(dòng)力學(xué)

自噬是細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)(包括可溶性大分子和細(xì)胞器)被運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解的途徑的總稱[6]。至少有3種不同類型的自噬，包括巨型自噬、伴侶介導(dǎo)的自噬和微型自噬。巨型自噬，通常簡(jiǎn)稱為自噬，是本綜述的主題。在這個(gè)途徑中，細(xì)胞質(zhì)的一部分(直徑通常為0.5～1 μm)被一個(gè)隔離膜或“噬菌體”吞噬，形成一個(gè)被稱為自噬小體的雙層膜結(jié)構(gòu)。自噬小體的外膜與溶酶體融合形成自噬溶酶體，導(dǎo)致溶酶體酶對(duì)自噬小體內(nèi)容物的降解。自噬小體形成需要ULK1蛋白激酶復(fù)合體、Beclin-1-Vps34激酶復(fù)合體和兩個(gè)泛素樣結(jié)合系統(tǒng)，其中一個(gè)系統(tǒng)由自噬相關(guān)基因5( autophagy related gene 5,ATG5)和自噬相關(guān)基因12(autophagy related gene 12,ATG12)形成，另一個(gè)系統(tǒng)由微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain 3,LC3)形成。自噬小體也可以與核內(nèi)體或多囊泡小體和主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅱ類負(fù)載室融合[7]。隨著更多的自噬小體和溶酶體融合，自噬溶酶體變得更大，但在終止期，溶酶體被管狀和碎片化以進(jìn)行更新[8]。

自噬小體形成的膜動(dòng)力學(xué)涉及復(fù)雜的過程，目前還不完全清楚。但最近的一些研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)對(duì)自噬小體的形成至關(guān)重要。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池通常與自噬小體的發(fā)育有關(guān)，電子斷層掃描分析表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和自噬體膜之間有直接聯(lián)系[9-10]。

除了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外，其他膜也可能參與自噬小體的形成。ATG9是另一種多跨膜蛋白，在自噬以及反式高爾基網(wǎng)絡(luò)、核內(nèi)體和自噬體前體之間的運(yùn)輸中起著至關(guān)重要的作用[11-12]。研究表明，線粒體、質(zhì)膜和核膜也可能是自噬小體膜的來源[13-15]。然而，缺乏對(duì)自噬體膜上這些結(jié)構(gòu)的特異性蛋白標(biāo)記的檢測(cè)，使得幾十年來自噬體膜來源的問題沒有得到解答。細(xì)胞可能在不同的環(huán)境中使用不同的膜源來形成自噬小體，從而允許膜動(dòng)力學(xué)的專一化，以及不同的自噬誘導(dǎo)信號(hào)刺激捕獲空間上不同的物質(zhì)。

2 自噬與抗感染

在多細(xì)胞動(dòng)物中，自噬途徑和/或自噬蛋白在抵抗細(xì)菌、病毒和原生動(dòng)物感染方面起著至關(guān)重要的作用。自噬基因的遺傳缺失或敲除通過阻止植物固有免疫或超敏反應(yīng)過程中程序性細(xì)胞死亡的失控?cái)U(kuò)散來保護(hù)植物免受病毒、真菌和細(xì)菌感染[16]。在其他生物中，自噬蛋白以細(xì)胞自主的方式控制細(xì)胞內(nèi)病原體的感染。在果蠅中，自噬基因突變?cè)黾恿藢?duì)病毒(水泡性口炎病毒)和細(xì)菌(單核細(xì)胞增生性李斯特菌)感染的易感性[17-18]。在網(wǎng)柄菌屬和秀麗隱桿線蟲中，自噬基因突變?cè)黾恿藢?duì)致死性鼠傷寒沙門氏菌感染的易感性[19]。在小鼠中，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中ATG5的敲除增加了感染單核細(xì)胞增生性李斯特菌和原生動(dòng)物弓形蟲的易感性[20]，而神經(jīng)元特異性的ATG5敲除增加了中樞神經(jīng)系統(tǒng)辛德畢斯病毒感染的易感性[21]。在體外研究中，自噬途徑和蛋白質(zhì)也可能具有“前病毒”或“概率”效應(yīng)；然而，到目前為止，這種效應(yīng)在體內(nèi)的證據(jù)還很缺乏。自噬基因介導(dǎo)體內(nèi)感染抵抗的機(jī)制尚不完全清楚，但可能涉及異源吞噬、其他自噬蛋白對(duì)微生物復(fù)制或生存的依賴效應(yīng)、先天和獲得性免疫反應(yīng)的激活和/或病原體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的改變。

牙齦卟啉單胞菌(porphyromonas gingivalis,Pg)是慢性牙周病發(fā)生和發(fā)展的主要牙周病原體，并在2016年首次被證實(shí)與食管癌的臨床病理學(xué)特征、患者5 a總生存有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)[22]。Pg通過脂筏與早期吞噬小體結(jié)合，侵襲多種細(xì)胞，包括牙齦上皮細(xì)胞、頰上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[23-25]。研究表明，自噬在防御Pg感染方面起著至關(guān)重要的作用。Pg脂多糖(porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,LPS)導(dǎo)致活性氧介導(dǎo)的自噬[26]，Pg的脂蛋白基因PG0717是Saos-2細(xì)胞系激活自噬所必需的[27]。Pg能激活LC3-I/LC3-II的轉(zhuǎn)化，增加ATG5-ATG12的結(jié)合力和Beclin-1的表達(dá)，并以多種感染依賴方式增加自噬小體的形成和自噬溶酶體的形成[28]。Pg與自噬體結(jié)合，并通過延遲晚期自噬體與溶酶體的融合來破壞自噬。

3 微生物反擊

當(dāng)微生物發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，需要制定阻止宿主防御機(jī)制的策略，此類策略的數(shù)量是宿主防御機(jī)制在免疫中重要性的替代措施。病毒和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出多種方式來適應(yīng)宿主的自噬[1,29]。它們可以對(duì)抗自噬啟動(dòng)或自噬成熟，逃避自噬識(shí)別，或利用自噬途徑的組成部分促進(jìn)自身復(fù)制或細(xì)胞內(nèi)生存。此外，微生物對(duì)自噬的拮抗作用不僅阻止了細(xì)胞內(nèi)病原體的異源降解，還阻止了自噬在先天免疫和獲得性免疫中的功能。

病毒阻斷自噬的策略包括阻斷自噬上游正調(diào)控因子，例如干擾素誘導(dǎo)的RNA激活的eIF2α蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)信號(hào)通路、激活自噬負(fù)調(diào)控因子(如營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)TOR激酶信號(hào)通路)或直接拮抗自噬機(jī)制[29]。

細(xì)菌擁有多種策略來避免通過自噬溶酶體途徑降解。許多存在于吞噬體或其他空泡區(qū)室中的細(xì)菌具有抑制溶酶體融合或成熟的方法，就分枝桿菌而言，可以通過刺激自噬的治療方法來部分克服[1,30]。Pg也可以通過逃避自噬在胞內(nèi)長(zhǎng)期存活。LPS是Pg細(xì)菌表面的重要毒力因子之一。LPS的脂質(zhì)A成分能夠被人類多種細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)，如Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)所識(shí)別，二者的相互作用引起宿主細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生。然而，一些內(nèi)化于胞內(nèi)的細(xì)菌在自噬途徑中可抑制自噬體的成熟或延緩自噬體與溶酶體的融合，使細(xì)菌在胞內(nèi)得以生存和增殖。胞內(nèi)Pg的定位可能因宿主細(xì)胞類型不同而異，Pg可位于不同的細(xì)胞器，如細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)體和自噬體中[31]。利用宿主自噬途徑逃避固有免疫是Pg在宿主體內(nèi)持續(xù)存在的一種獨(dú)特策略。Lee等[32]證實(shí)了Pg利用富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的自噬體成功地持續(xù)存在，并避開了抗微生物泛素—溶酶體降解途徑。Pg通過Mfa1菌毛靶向DC-SIGN(樹突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子3結(jié)合非整合素因子)的機(jī)制來破壞自噬從而在樹突狀細(xì)胞中存活[33]。

4 免疫信號(hào)分子對(duì)自噬的調(diào)控

大量調(diào)節(jié)自噬的免疫相關(guān)信號(hào)分子進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了自噬在免疫中的重要性。一些研究表明[2-4,30]，自噬由不同家族的病原體識(shí)別受體(如TLR、NOD樣受體和雙鏈核糖核酸結(jié)合蛋白PKR)、DAMPS(如ATP、ROS和錯(cuò)誤折疊蛋白)、病原體受體(如CD46)、干擾素-γ及其下游免疫相關(guān)的GTP酶、DAP激酶、JNK、CD40、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、NF-κB抑制劑(IKK)和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)等誘導(dǎo)。高遷移率族蛋白(high mobility group box,HMGB)也被證明既是天然免疫信號(hào)中核酸的通用感受器[34]，也是自噬的誘導(dǎo)者[35]。自噬被BCL2、NF-κB、TH2細(xì)胞因子和典型的營(yíng)養(yǎng)敏感胰島素-AKT-TOR途徑所抑制。

在大多數(shù)情況下，免疫相關(guān)信號(hào)分子控制自噬的機(jī)制還不清楚。然而，有一些例子表明免疫信號(hào)和自噬蛋白之間的特定相互作用可能與這些機(jī)制有關(guān)。例如，beclin-1和BCL2(抑制其活性)之間的相互作用被認(rèn)為是被TLR(toll-like receptors)銜接子髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response proteon 88,MyD88)和β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)以及HMGB1破壞的，它們與beclin-1結(jié)合并取代BCL2[3,33]。負(fù)責(zé)在細(xì)菌感染時(shí)誘導(dǎo)自噬的兩個(gè)細(xì)胞內(nèi)傳感器NOD1和NOD2與自噬相關(guān)基因16L1(autophagy-related 16-like 1 genes,ATG16L1)相互作用，并將其募集到質(zhì)膜，導(dǎo)致侵入性細(xì)菌(福氏志賀菌)與LC3的關(guān)聯(lián)增強(qiáng)[35]。與克羅恩病相關(guān)的NOD2突變損害了ATG16L1質(zhì)膜募集和細(xì)菌與LC3的共同定位[36]。

5 自噬與適應(yīng)性免疫

自噬蛋白在適應(yīng)性免疫中發(fā)揮作用，包括在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和動(dòng)態(tài)平衡以及抗原呈遞中發(fā)揮作用。小鼠特定淋巴細(xì)胞群體中不同自噬基因的敲除已顯示出自噬蛋白在維持B1a B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和胎兒造血干細(xì)胞的正常數(shù)量中起著至關(guān)重要的作用[2,37-38]。在T細(xì)胞中，線粒體數(shù)量在胸腺細(xì)胞向成熟循環(huán)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過程中受到發(fā)育調(diào)節(jié)，自噬缺陷細(xì)胞的發(fā)育缺陷可能與線粒體清除缺陷有關(guān)[37]。自噬在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和動(dòng)態(tài)平衡中的另一個(gè)關(guān)鍵功能是清除胸腺中的自體反應(yīng)性T細(xì)胞[37]。胸腺上皮細(xì)胞中存在高水平的自噬，其中自噬參與了自身抗原向MHCⅡ類負(fù)荷室的運(yùn)送。胸腺上皮細(xì)胞ATG5的基因破壞導(dǎo)致某些MHCⅡ類限制性T細(xì)胞特異性和自身免疫的選擇改變[39]。

自噬蛋白可能參與抗原提呈的不同過程，包括向CD4+T細(xì)胞遞送內(nèi)源性MHCⅡ類抗原，促進(jìn)抗原供體細(xì)胞向CD8+T細(xì)胞的交叉遞呈，樹突狀細(xì)胞向CD4+T細(xì)胞遞呈吞噬的抗原，以及MHCⅠ類抗原遞呈給CD8+T細(xì)胞。

6 自噬蛋白對(duì)免疫信號(hào)的調(diào)節(jié)

自噬蛋白在固有免疫信號(hào)的激活和失活中發(fā)揮作用[4]。自噬途徑通過將病毒核酸遞送至內(nèi)體Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)來激活漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞中Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[40]。相比之下，自噬蛋白通過自噬消除受損的線粒體或減少活性氧[41]并通過ATG5-ATG12與RIG- I樣受體(RIG-I-like receptors,RLR)信號(hào)分子的胱天氨酸募集結(jié)構(gòu)域結(jié)合[42]，負(fù)調(diào)節(jié)RLR介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。此外，自噬蛋白ATG9A，而不是ATG7，負(fù)向調(diào)節(jié)干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING)的激活，而STING是激活Ⅰ型干擾素和刺激DNA產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子所必需的[11]。因此，自噬蛋白似乎可以通過自噬依賴和非自噬兩種機(jī)制負(fù)向調(diào)節(jié)干擾素的產(chǎn)生。

自噬通路和/或蛋白質(zhì)在控制炎癥信號(hào)中也起著至關(guān)重要的作用。一個(gè)主要作用是調(diào)節(jié)炎癥的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。自噬缺陷細(xì)胞中積累的銜接蛋白p62水平升高，通過涉及腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6 ,TRAF6)寡聚的機(jī)制激活促炎轉(zhuǎn)錄因子NF-κB[43]。自噬蛋白在炎癥信號(hào)傳導(dǎo)中的第二個(gè)重要作用是在炎癥小體水平。該復(fù)合體包含NOD樣受體低溫比林蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)和胱天氨酸酶1，并被細(xì)胞感染或其他應(yīng)激激活，從而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和IL-18的成熟[4]。

7 自噬與炎癥性疾病

自噬蛋白依賴的免疫功能紊亂不僅可能增加感染的易感性，還可能導(dǎo)致慢性炎癥性疾病和自身免疫性疾病。自噬的異常亦有助于許多疾病中炎癥的發(fā)生和發(fā)展。迄今為止，唯一明確的聯(lián)系是自噬調(diào)節(jié)因子的突變和克羅恩病之間的聯(lián)系。在其他疾病(胃食管反流病、Barrett食管)，自噬作用的直接證據(jù)是有限的[44]。在一項(xiàng)研究中，與來自Barrett食管患者的細(xì)胞系相比，正常食管鱗狀上皮細(xì)胞和受膽管成分去氧膽酸刺激的鱗狀細(xì)胞均表現(xiàn)出更高水平的Beclin-1表達(dá)[45]。雖然急性暴露于去氧膽酸可以誘導(dǎo)這些Barrett食管細(xì)胞系的Beclin-1表達(dá)和自噬，但在慢性暴露后這部分的水平下降。相比之下，其他研究人員分析了活檢標(biāo)本中自噬囊泡的形態(tài)學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)盡管自噬水平相對(duì)于生長(zhǎng)異常Barrett食管中的正常細(xì)胞普遍降低，但Barrett食管中的自噬水平與正常的鱗狀黏膜相比增加[45]。

8 自噬與食管腫瘤

自噬發(fā)生在包括食管在內(nèi)的大多數(shù)組織類型的基礎(chǔ)水平[46-47]，并已被證明是在對(duì)各種應(yīng)激源(包括饑餓、缺氧和炎癥)的反應(yīng)中誘導(dǎo)的。對(duì)于癌癥來說，自噬的作用是復(fù)雜的。自噬在早期癌變中起抑癌作用。然而，在已發(fā)生的腫瘤中，自噬作為一種腫瘤促進(jìn)因子，有助于瘤細(xì)胞在惡劣的腫瘤微環(huán)境中生存以及應(yīng)對(duì)治療相關(guān)的應(yīng)激[48]。在食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中誘導(dǎo)自噬囊泡形成的細(xì)胞因子中，有一個(gè)共同的聚集點(diǎn)是UNC-51樣自噬激活激酶1(unc-51-like kinase 1,ULK1)。ULK1是一種對(duì)自噬囊泡形成必不可少的絲氨酸/蘇氨酸激酶[49-50]，它通過調(diào)節(jié)幾條上游信號(hào)通路來誘導(dǎo)食管癌相關(guān)自噬的發(fā)生。AMP活化蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是一種自噬激活劑，通過直接磷酸化ULK1以及磷酸化與ULK相互作用的蛋白發(fā)揮作用[51]。AMPK/ULK1軸與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)-基因1(metastasis-associated in colon cancer-1,MACC1)誘導(dǎo)的自噬激活有關(guān)。在使用食管癌細(xì)胞系ECA9706和KYSE150進(jìn)行的體外研究中，證明MACC1以一種依賴自噬的方式促進(jìn)食管癌的增殖、遷移和侵襲[52]。自噬與Claudin 1d蛋白介導(dǎo)的這些ESCC細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲的增加有關(guān)，因?yàn)檫@些表型被一種可阻斷自噬囊泡形成的Ⅲ類PI3激酶抑制劑3-甲基腺嘌呤取消。雖然Claudin 1蛋白的過表達(dá)也促進(jìn)了原代正常食管上皮細(xì)胞中AMPK的激活，但沒有觀察到下游自噬的誘導(dǎo)。因此，Claudin 1蛋白在正常細(xì)胞中的功能可能與其在惡性細(xì)胞中的功能不同。

常用的化療藥物順鉑和5-氟尿嘧啶(5-fluouracil，5FU)在體外均能誘導(dǎo)ESCC和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)細(xì)胞的自噬[53-58]。在一項(xiàng)研究中，ESCC細(xì)胞系OE21和EAC細(xì)胞系OE33顯示出對(duì)5FU和順鉑的敏感性，這與細(xì)胞凋亡和缺乏自噬誘導(dǎo)有關(guān)[53]。而對(duì)5FU和順鉑耐藥的食管癌細(xì)胞株KYSE450和EAC細(xì)胞株OE19均可誘導(dǎo)自噬[57]。在KYSE450中，Beclin-1和ATG7的基因抑制共同減少了5FU處理后自噬囊泡的誘導(dǎo)，同時(shí)降低了細(xì)胞存活率，表明自噬參與了化療耐藥性的產(chǎn)生。在這項(xiàng)研究的后續(xù)研究中，發(fā)現(xiàn)對(duì)5FU敏感的OE21和OE33細(xì)胞系中的凋亡與泛素樣蛋白修飾物干擾素刺激基因15(the ubiquitin-like protein modifier interferon-stimulated gene 15 ,IGS15)的上調(diào)有關(guān)，IGS15起到了阻斷自噬的作用[59]。IGS15調(diào)節(jié)自噬的機(jī)制以及靶向IGS15在5FU治療中的應(yīng)用仍有待確定。

9 未來展望

證明自噬被用來攻擊入侵細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的第一系列研究發(fā)表于2004年[60]。雖然在幾十年前就已經(jīng)在細(xì)菌和病毒感染的細(xì)胞中觀察到了自噬現(xiàn)象，但這一系列研究仍是一個(gè)開創(chuàng)性的進(jìn)步。在過去的幾年里，自噬領(lǐng)域的研究揭示了這組基因的復(fù)雜性和功能多樣性，不僅可以保護(hù)多細(xì)胞生物免受感染的威脅，還能抵御宿主自身對(duì)感染的反應(yīng)的威脅。最近的研究進(jìn)展可能不僅修改了對(duì)免疫的認(rèn)識(shí)，而且也重塑了對(duì)炎癥疾病發(fā)病機(jī)制的理解。

許多研究證明，自噬是促成食管癌發(fā)病的一個(gè)因素，并支持進(jìn)一步探索自噬調(diào)節(jié)劑作為工具，來提高對(duì)食管癌現(xiàn)有和實(shí)驗(yàn)療法的反應(yīng)。由于自噬在食管癌細(xì)胞中是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，在環(huán)境依賴的方式下被調(diào)節(jié)，未來的研究界定自噬在健康和疾病條件下食管癌生物學(xué)中的作用，對(duì)于指導(dǎo)食管癌中靶向自噬的治療策略至關(guān)重要。研制具有特異性和強(qiáng)效激活或抑制自噬能力的藥物對(duì)于研究自噬在癌癥生物學(xué)中的作用具有重要意義。