微RNA參與調(diào)控肝纖維化的研究進(jìn)展

李燚，陳睿，蒙增萍，申涌，陳瑜，劉詠梅

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 a.針灸推拿科，b.臨床檢驗(yàn)中心，貴陽 550004)

肝纖維化作為各種慢性肝損傷發(fā)展的終末階段，已成為威脅全球人口健康的問題[1]。若未得到有效治療，肝纖維化極有可能轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不踔粮渭?xì)胞癌，如在肝纖維化早期階段對肝損傷患者進(jìn)行積極治療，可使肝纖維化消退，逆轉(zhuǎn)惡性后果，但目前尚未發(fā)現(xiàn)通用的特異性藥物，仍只限于針對相應(yīng)病因進(jìn)行治療[2]。酒精性及非酒精性肝病、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、藥物和微生物誘發(fā)的慢性肝損傷均可導(dǎo)致肝臟病變，使肝臟發(fā)生纖維化[3]。肝纖維化以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度累積和肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化為特征[4]。正常生理?xiàng)l件下，HSC處于靜息狀態(tài)，其胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的脂質(zhì)顆粒，能夠儲存維生素A；肝臟受損后，HSC活化產(chǎn)生多種炎癥因子及相關(guān)酶蛋白，參與肝臟的傷口愈合反應(yīng)，同時靜息HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，在肝組織內(nèi)產(chǎn)生過多膠原纖維、α-平滑肌肌動蛋白等ECM成分，ECM合成與降解的動態(tài)平衡被打破，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂發(fā)生重塑，逐漸發(fā)展為肝纖維化[4-6]。研究證明，多種外源性或內(nèi)源性微RNA(microRNA，miRNA)可參與肝纖維化過程的調(diào)節(jié)[6-7]?，F(xiàn)就miRNA在肝纖維化中的表達(dá)調(diào)控作用進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步尋找肝纖維化的治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 miRNA的合成及功能

miRNA主要由RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ(DROSHA、DICER)所轉(zhuǎn)錄，在真核生物胞核內(nèi)，DROSHA、雙鏈RNA結(jié)合蛋白、DiGeorge綜合征關(guān)鍵區(qū)域8基因及相關(guān)蛋白組成微處理器復(fù)合體催化RNA生成約70 nt的莖環(huán)前體miRNA，即pre-miRNA；而后輸出受體將其輸入胞質(zhì)，此時DICER酶對pre-miRNA進(jìn)行再加工，生成miRNA雙鏈體，解旋后其中一條鏈被降解，另一條鏈成為18～25 nt的成熟單鏈miRNA，與AGO蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，隨后與靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3′非翻譯區(qū)或5′非翻譯區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯，發(fā)揮生物學(xué)功能[8-11]。

miRNA有多種表達(dá)模式，一個miRNA可以靶向數(shù)百個mRNA，且一個mRNA可受數(shù)個miRNA的控制，它們共同形成調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，影響多個功能相關(guān)的基因表達(dá)[12]。miRNA可參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移、衰老、死亡等過程，肝臟中的miRNA通過調(diào)控脂質(zhì)代謝[13]、HSC的靜默或活化[6]以及其他途徑參與肝內(nèi)代謝活動或疾病進(jìn)程。研究證實(shí)，miRNAs與病毒相關(guān)的肝纖維化[14]、寄生蟲性肝纖維化[15]、酒精性肝病[16]等肝臟疾病密切相關(guān)。

2 miRNA在肝纖維化中的表達(dá)

肝纖維化是一個涉及多病因、多信號的復(fù)雜肝臟損傷后的修復(fù)反應(yīng)，也是一個動態(tài)的、可逆的病理生理過程，其基因表達(dá)調(diào)控的變化與miRNA的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)相關(guān)。肝損傷后循環(huán)中的特異miRNA可作為早期診斷肝纖維化的標(biāo)志物，此外還可通過動態(tài)監(jiān)測隨肝臟疾病進(jìn)展變化的miRNA監(jiān)控疾病狀態(tài)[17-18]。循環(huán)中的miRNA在細(xì)胞死亡過程中通過外泌體或微囊泡分泌運(yùn)輸，肝臟中各類肝細(xì)胞釋放含有miRNA的外泌體或微囊泡后，被鄰近細(xì)胞攝取或進(jìn)入循環(huán)，傳遞調(diào)控信號；進(jìn)入血液、尿液、腦脊液等體液中的miRNA因被包裹而較其他單獨(dú)存在的miRNA更具穩(wěn)定性[19-21]。

不同miRNA在肝纖維化的發(fā)展中起促進(jìn)或抑制作用，表現(xiàn)為在肝組織、肝細(xì)胞、循環(huán)中的上調(diào)或下調(diào)，目前發(fā)現(xiàn)的在肝纖維化或其他肝病進(jìn)展中上調(diào)的miRNA包括miR-122[22]、miR-221/222[23-24]、miR-192[25]、miR-16、miR-146、miR-571[26]、miR-34a[27]等，下調(diào)的miRNA包括miR-29a[28]、miR-30a[29]、miR-542、miR-652[26]等，有些miRNA(miR-29b、miR-155等)在不同情況下表現(xiàn)為抗纖維化或促纖維化的潛能，對肝纖維化進(jìn)展具有雙重作用。

3 miRNA在肝纖維化中的調(diào)控

不同miRNA表達(dá)模式所形成的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)節(jié)能夠特定地改變大多數(shù)急性或慢性肝臟疾病，在肝纖維化中，miRNA通過調(diào)控不同信號分子或改變疾病某一過程表現(xiàn)出抵抗或促進(jìn)肝纖維化的能力，同時miRNA在外源性藥物或抑制劑干擾下的表達(dá)也能作為肝纖維化治療的潛在位點(diǎn)。

3.1miRNA促進(jìn)肝纖維化 miR-155在炎癥反應(yīng)中起重要作用，可參與脂肪性肝炎和肝纖維化等肝損傷過程，具有促進(jìn)與抑制纖維化的雙重作用[30-32]。Bala等[32]發(fā)現(xiàn)，酒精性肝病小鼠模型的miR-155上調(diào)，而敲除miR-155后，小鼠肝細(xì)胞與巨噬細(xì)胞中過氧化物酶體增殖物激活受體反應(yīng)元件和過氧化物酶體增殖物激活受體α基因結(jié)合增加，肝臟炎癥減輕，肝纖維化緩解。此外，在酒精性肝炎大鼠中，沉默miR-155可上調(diào)細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1，使促分裂原活化的蛋白激酶信號通路失活，抑制酒精性HSC增殖，促進(jìn)凋亡[31]，提示外源性miR-155的表達(dá)降低可作為減輕肝纖維化的一種治療方式。

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染時，肝臟大量產(chǎn)生miR-192，Kim等[25]采用體外共培養(yǎng)HCV感染肝細(xì)胞及人源HSC系LX-2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HCV誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生并釋放外泌體miR-192，隨后激活HSC，同時外泌體miR-192通過轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1刺激人原代HSC轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。病毒誘導(dǎo)的miR-192通過下調(diào)鋅指E盒結(jié)合同源蛋白1刺激TGF-β1轉(zhuǎn)錄增加，miR-192與TGF-β1形成的正反饋環(huán)放大了TGF-β1在病毒感染中的促炎作用[33]，提示病毒可誘導(dǎo)miR-192產(chǎn)生，并促進(jìn)病毒性纖維化的發(fā)展。

miR-199在肝病發(fā)展中起正向作用。一項(xiàng)埃及的臨床研究顯示，HCV感染患者血清miR-199顯著上調(diào)，血清miR-199水平診斷晚期肝纖維化的靈敏度和特異度均較高[34]。Yang等[35]發(fā)現(xiàn)，TGF-β誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Twist1表達(dá)增加，通過驅(qū)動HSC中miR-199a-3p上調(diào)，促進(jìn)纖維化的發(fā)生發(fā)展，該效應(yīng)由miR-199a-3p靶向抑制小窩蛋白2使TGF-β信號增強(qiáng)而產(chǎn)生，提示沉默miR-199可能是有效治療肝纖維化的方法之一。

miR-34a/沉默信息調(diào)節(jié)因子1/p53信號通路在肝纖維化中發(fā)揮作用。Tian等[36]在共培養(yǎng)的肝細(xì)胞與HSC中發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞中miR-34a/沉默信息調(diào)節(jié)因子1/p53信號通路激活后，凋亡肝細(xì)胞及活化HSC增加，肝纖維化發(fā)展。miR-34a與慢性丙型病毒性肝炎進(jìn)展為早期或晚期肝纖維化具有相關(guān)性。Li等[37]的研究顯示，慢性丙型病毒性肝炎患者血清高miR-34a水平與低生存率相關(guān)，肝纖維化程度越重，miR-34a水平越高，沉默信息調(diào)節(jié)因子1下調(diào)以及乙?；痯53上調(diào)越顯著，慢性丙型病毒性肝炎向肝纖維化進(jìn)展越迅速，說明miR-34a可作為預(yù)測肝纖維化發(fā)展的指標(biāo)。

3.2miRNA抑制肝纖維化 miR-122是成人肝組織中表達(dá)最豐富的miRNA，約占肝臟總miRNA的70%[38]。Cheng等[39]發(fā)現(xiàn)，miR-122可抑制TGF-β1/Smad4信號誘導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程，并負(fù)向調(diào)控HSC的活化。miR-122也可通過參與肝臟慢性炎癥及脂質(zhì)代謝起作用，Satishchandran等[16]發(fā)現(xiàn)，酒精可使人和動物肝臟中具有肝細(xì)胞特異性的miR-122表達(dá)減少，進(jìn)而促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α與過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達(dá)，導(dǎo)致脂肪變性及炎癥發(fā)生，使酒精性肝病逐漸發(fā)展為肝纖維化，而miR-122水平的恢復(fù)可抑制以上途徑，改善酒精性肝損傷。另有研究表明，抑制肝臟模型中miR-122的表達(dá)可導(dǎo)致肝臟炎癥、壞死、脂肪變性[40]，提示維持肝臟miR-122較高水平有利于延緩肝炎患者的肝纖維化進(jìn)展。

纖維化肝臟中miR-29家族(包括miR-29a、miR-29b、miR-29c)顯著下調(diào)，其中miR-29a表現(xiàn)最明顯。miR-29a通過抑制CD36改善高脂飲食誘導(dǎo)肝纖維化模型小鼠皮下、內(nèi)臟和腸道脂肪累積和肝細(xì)胞的脂肪變性，使小鼠體重減輕，而過表達(dá)miR-29a在EMT和肝纖維化中發(fā)揮保護(hù)作用[28]。Matsumoto等[41]對四氯化碳以及硫代乙酰胺肝纖維化小鼠模型的實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，miR-29a可直接靶向抑制Ⅰ型膠原A1和血小板源性生長因子C信使RNA的表達(dá)，減少ECM的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞增殖和分化，同時miR-29a可通過提高胱天蛋白酶9的活性誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞的凋亡，改善小鼠模型的肝纖維化程度。Yang等[42]證明，靜脈注射miR-29a可通過直接靶向抑制磷脂酰肌醇-3-激酶p85α減輕膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷和纖維化。由此可見，在不同致肝損傷物誘導(dǎo)的肝纖維化模型小鼠中，miR-29a均表現(xiàn)出對肝纖維化過程關(guān)鍵步驟的抑制作用，提示可使用一種miRNA改善不同原因引起的肝纖維化。

miR-30a可減輕肝纖維化。Chen等[29]發(fā)現(xiàn)，通過結(jié)扎膽管或四氯化碳誘導(dǎo)而建立的肝纖維化模型的miR-30a表達(dá)下調(diào)，而靶蛋白Beclin-1表達(dá)增加。采用miR-30a模擬物使miR-30a在體外培養(yǎng)HSC中高表達(dá)，進(jìn)而使ECM產(chǎn)生減少，HSC脂質(zhì)累積增加，而敲除Beclin-1后，纖維化標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白、Ⅰ型膠原和組織金屬蛋白酶抑制劑1、自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ/Ⅰ蛋白均表達(dá)下調(diào)，說明miR-30a可抑制Beclin-1介導(dǎo)的自噬，可在一定程度上發(fā)揮抗纖維化作用[29]。miR-30a過表達(dá)可通過靶向結(jié)合Snail抑制EMT過程，進(jìn)而抑制HSC活化[43]，天然藥物胸腺醌可上調(diào)miR-30a的表達(dá)，通過作用于EMT發(fā)揮抗纖維化作用[44]。

miR-155具有抗纖維化的潛能。研究表明，miR-155在肝硬化患者血清及活化的HSC中表達(dá)降低，miR-155通過靶向激活血管緊張素Ⅱ受體1與T細(xì)胞因子4參與EMT和胞外信號調(diào)節(jié)激酶1信號通路；而在HSC-T6細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染的miR-155可通過促進(jìn)胱天蛋白酶3表達(dá)并降低B細(xì)胞淋巴瘤-2水平，抑制活化的肝成纖維細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)HSC凋亡，提示miR-155可能成為肝纖維化治療的潛在靶標(biāo)[45]。

此外，其他miRNA亦可抑制肝纖維化發(fā)展，如miR-194能夠抑制HSC的活化和增殖，抑制癌基因蛋白激酶B2，部分減輕肝纖維化[46]；中性粒細(xì)胞來源的miR-223通過抑制非酒精性脂肪性肝炎向纖維化的發(fā)展發(fā)揮抗炎作用[47]；miR-876通過骨膜素抑制EMT狀態(tài)以及肝纖維化向肝癌的發(fā)展，影響肝細(xì)胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后[48]；miR-455-3p通過抑制熱激轉(zhuǎn)錄因子1的表達(dá)減緩HSC的激活及肝纖維化[49]。以上研究提示，內(nèi)源性或外源性干擾miRNA表達(dá)可作為治療肝纖維化的潛在途徑，為臨床藥物開發(fā)提供基礎(chǔ)。

4 基于miRNA診斷治療肝纖維化

4.1基于miRNA的肝纖維化評估 正確有效的肝纖維化評估有利于預(yù)測、治療、監(jiān)測慢性肝病。肝臟組織活檢為有創(chuàng)檢查，具有一定風(fēng)險(xiǎn)，雖有助于明確肝病類型及進(jìn)展，但只能檢測某一時間點(diǎn)的情況，結(jié)果具有一定的主觀性[50]?；谘荷飿?biāo)志物和瞬時彈性成像技術(shù)的非侵襲性檢測手段對纖維化程度隨時間的細(xì)微變化不敏感，難以判斷疾病進(jìn)展過程[50]。

血液或其他體液中的miRNA隨時間變化，且不同疾病進(jìn)程具有特征性改變，如血清外泌體miRNA可用于肝纖維化疾病分級，外泌體miR-92a-3p、miR-146a-5p和miR-532-5能夠區(qū)分Ⅰ～Ⅲ級肝纖維化患者以及健康者；輕型(0～Ⅰ級)和重型纖維化(Ⅱ～Ⅲ級)可通過血清外泌體miR-146-5p水平進(jìn)行判斷[15]。Abdel-Al等[23]的實(shí)驗(yàn)表明，在HCV相關(guān)肝纖維化肝組織中，miR-16、miR-146a-5p、miR-122、miR-222表達(dá)上調(diào)，且在早期和晚期肝纖維化中均顯著上調(diào)；與miR-16、miR-146相比，miR-221/222診斷晚期肝纖維化的靈敏度和特異度更高，可作為預(yù)測HCV誘導(dǎo)的肝纖維化和預(yù)后的生物標(biāo)志物。

miRNA能夠發(fā)揮抑制或促進(jìn)肝纖維化的作用，且循環(huán)miRNA水平在肝纖維化發(fā)展中的變化趨勢穩(wěn)定[19-22,25,28-29]，故檢測循環(huán)miRNA有助于更好地診療疾病，且檢測標(biāo)本易收集、對患者無傷害、風(fēng)險(xiǎn)較低或無風(fēng)險(xiǎn)，可作為疾病進(jìn)展及預(yù)后判斷的指標(biāo)，并具有肝組織活檢、血液生物標(biāo)志物、瞬時彈性成像等臨床常用指標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)[50]。由于體液miRNA水平受患者機(jī)體內(nèi)環(huán)境的影響，同一時間個體間以及不同時間同一個體的miRNA差異較明顯，故同一疾病不同病程不同患者體液miRNA水平的變化難以統(tǒng)一，未來不同人群miRNA的標(biāo)準(zhǔn)檢測仍需深入研究。

4.2基于miRNA的肝纖維化治療 目前，肝纖維化的治療策略是針對原發(fā)病的病因治療、抗炎治療以及其他抗纖維化治療[3]。由慢性病毒性肝病引起的肝纖維化可使用抗病毒藥物，在肝炎病毒慢性感染階段直接使用抗病毒藥物，使病毒產(chǎn)生持續(xù)性病毒應(yīng)答，可直接顯著減輕肝炎病毒感染程度，臨床常用利巴韋林、恩替卡韋等抗病毒治療藥物[51-52]，但由于藥物在體內(nèi)循環(huán)運(yùn)輸過程中可能有損失，不同患者的有效治療藥物劑量不同，故給藥方式及治療劑量應(yīng)個體化。靶向抑制與HCV感染進(jìn)展緊密相關(guān)的miR-122、miR-192、miR-221/222等可能是一種有效的治療方式[23,53]。對于非酒精性或酒精性脂肪性肝病患者，可早期進(jìn)行人為干預(yù)，如改變生活方式、保持正常體重等；對于自身免疫性肝炎患者，可使用免疫抑制劑等。其他可減輕肝纖維化狀態(tài)的治療方式包括誘導(dǎo)活化HSC凋亡[20]、抑制活化HSC的細(xì)胞因子[54]等。miRNA可通過TGF-β1/Smads信號、核因子κB信號及胞外信號調(diào)節(jié)激酶發(fā)揮抗炎、抑制HSC活化、減少肝細(xì)胞凋亡的作用，進(jìn)而減輕肝纖維化[10]，與Sun等[55]從老鼠簕(Acanthus ilicifolius)篩選的有效成分4-羥基-苯并唑-2-酮在肝纖維中的作用類似。某些藥物的肝臟毒性作用較大，其應(yīng)用受限，同時針對肝纖維化原發(fā)病的治療藥物的有效性隨時間及病程變化而逐漸降低，因此以miRNA為基礎(chǔ)開發(fā)安全有效的新型治療藥物在控制肝纖維化方面有廣闊的應(yīng)用前景[10]。

5 小 結(jié)

miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。隨著高通量組學(xué)及其他相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，有病理意義且在肝臟疾病中具有明確特異性調(diào)節(jié)功能的miRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，這些miRNA具有肝纖維化診斷分級、治療及預(yù)后監(jiān)測的潛力，對未來臨床治療方案的制訂有一定幫助。目前，肝纖維化中miRNA作用的研究多集中于單個miRNA及其具體機(jī)制的臨床前作用，對臨床中miRNA調(diào)控作用的研究較少，miRNA作為新的非侵入性肝纖維化早期診斷生物標(biāo)志物的有效性、特異性、敏感性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。