外泌體在骨科疾病治療中的作用

王鑫 付海亮

運用各種間充質干細胞、生長因子、支架的干細胞療法是較有前景的組織再生策略之一。越來越多的研究表明，間充質干細胞的生物學效應來源于其分泌的外泌體。外泌體能展現(xiàn)出與其來源細胞相似的生物學特性，且直接應用外泌體治療無明顯不良反應，還能顯著降低免疫原性、致瘤性、血管堵塞等風險[1]。

1 外泌體構成及特點

外泌體是由細胞分泌的細胞外囊泡，直徑為40～100 nm。外泌體膜表面具有標志性膜蛋白如CD9、CD63、CD81等，膜內包裹著蛋白、核酸、脂質等活性物質。外泌體的脂膜能很好地保護其含有的生物活性物質使其不被降解，并將蛋白質、DNA、RNA等物質從母細胞轉移到靶細胞中。外泌體作為重要的旁分泌效應因子在細胞信息交流中發(fā)揮著重要的作用[2]。外泌體特性隨著細胞來源不同而不同，且同一細胞不同時間段、不同生理病理狀態(tài)下產生的外泌體也具有不同的特點。

2 外泌體治療骨科疾病

2.1 骨關節(jié)炎

骨關節(jié)炎(OA)是常見關節(jié)炎之一，其病理特征包括軟骨退化、軟骨下骨硬化、形成骨贅、發(fā)生滑膜炎癥和韌帶鈣化等。目前臨床上OA主要治療方式仍是口服非甾體類抗炎藥，然而其治標不治本，所以學者們仍在尋找新的治療策略。過往研究集中在干細胞治療，如關節(jié)內間充質干細胞可以阻止軟骨退化，延緩骨關節(jié)炎進程。后續(xù)研究表明，干細胞治療功能來自于其旁分泌作用，包括其分泌的外泌體和微粒等。

2.1.1 滑膜間充質干細胞來源外泌體

Tao等[3]研究發(fā)現(xiàn)，滑膜間充質干細胞(SMSC)來源外泌體含有Wnt5a和Wnt5b且能激活Yes相關蛋白(YAP)信號轉導通路，從而促進軟骨細胞增殖和遷移，但Wnt5a和Wnt5b激活YAP信號轉導通路會抑制SOX9的表達，同時使得軟骨細胞外基質分泌明顯減少。而經改造后高表達miR-140-5p的SMSC來源外泌體消除了這一不足，可使外泌體在不影響軟骨細胞外基質分泌的情況下促進關節(jié)軟骨細胞增殖和遷移，且可阻止大鼠OA發(fā)生。

Wnt5a是一種非典型的Wnt蛋白，關節(jié)包括軟骨、骨和關節(jié)腔等發(fā)育都高度依賴于Wnt信號轉導通路[4]。Wnt5a具有雙重功能：在軟骨形成早期，能激活軟骨細胞增殖，抑制軟骨細胞分化；在軟骨形成后期，能激活基質金屬蛋白酶(MMP)，減少軟骨形成和成熟軟骨細胞中軟骨細胞外基質合成。

2.1.2 骨髓間充質干細胞來源外泌體

Mao等[5]研究發(fā)現(xiàn)，高表達miR-92a-3p的骨髓間充質干細胞(BMSC)來源外泌體可靶向作用于Wnt5a mRNA的3′端非翻譯序列，抑制Wnt5a活性，從而抑制OA小鼠軟骨降解。在這項研究中Wnt5a的生物學作用與Tao等[3]的SMSC來源外泌體研究結果類似，區(qū)別在于后者通過miR-140-5p抑制了Wnt5a降解軟骨的負面作用，同時還保留了Wnt5b對軟骨的保護作用。

Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，人BMSC來源外泌體含有長鏈非編碼RNA(lncRNA)KLF3-AS1,它能作為內源競爭性RNA與miR-206基因進行結合，從而抑制miR-206基因調控作用，繼而進一步提高G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白-1(GIT-1)表達。研究表明，GIT-1能促進軟骨細胞增殖，抑制軟骨細胞凋亡[7]。Zhao等[8]研究發(fā)現(xiàn)，血小板衍生生長因子(PDGF)通過上調GIT-1表達促進軟骨細胞增殖并抑制軟骨細胞凋亡。而miR-206過表達和GIT-1基因敲除能逆轉BMSC來源外泌體對OA的治療效果，說明BMSC來源外泌體通過KLF3-AS1調控miR-206/GIT-1介導的軟骨細胞增殖、凋亡并促進軟骨修復[9]。

還有研究比較BMSC來源外泌體與微粒對OA的治療作用，結果表明BMSC來源外泌體與微粒具有類似的功能，即兩者皆可重建軟骨細胞穩(wěn)態(tài)，抑制軟骨細胞凋亡，刺激巨噬細胞向抗炎表型方向極化，且兩者都可抑制軟骨降解，阻斷小鼠OA發(fā)生[10]。

2.1.3 誘導性多功能干細胞來源外泌體

Zhu等[11]比較誘導性多功能干細胞來源外泌體與SMSC來源外泌體對小鼠OA的治療效果，結果顯示誘導性多功能干細胞來源外泌體治療效果更好。

2.1.4 胚胎干細胞誘導的間充質干細胞來源外泌體

胚胎干細胞誘導的間充質干細胞來源外泌體對OA具有良好的治療作用[12]。它通過增加Ⅱ型膠原合成和降低聚蛋白多糖酶降解酶-5表達維持軟骨細胞表型，并平衡軟骨細胞外基質合成與降解，阻止軟骨破壞。

2.2 糖皮質激素性股骨頭壞死

糖皮質激素性股骨頭壞死是一種進展性、致殘性關節(jié)疾病，常由長期口服類固醇激素引起。骨髓基質細胞、成骨細胞、血管內皮細胞凋亡，以及BMSC向脂肪細胞分化增加和骨形成畸形在這一病理過程中起著關鍵作用。因此，早期預防骨髓基質細胞凋亡，促進骨髓基質細胞增殖，預防BMSC向脂肪細胞分化可能可阻止糖皮質激素性股骨頭壞死進展。

2.2.1 SMSC來源外泌體

Guo等[13]通過靜脈注射SMSC來源外泌體治療大鼠糖皮質激素性股骨頭壞死，結果顯示治療組大鼠股骨頭軟骨下骨小梁完整且分布均勻，僅有20%的大鼠有非常輕微的骨壞死改變，對照組大鼠骨小梁厚度、骨體積(組織體積)、骨小梁數(shù)量明顯降低，出現(xiàn)明顯骨壞死，股骨頭松質骨稀疏甚至消失。這表明促進骨髓基質細胞增殖活性、抑制糖皮質激素引起的骨髓基質細胞凋亡可能是SMSC來源外泌體預防大鼠糖皮質激素性股骨頭壞死的潛在機制。

2.2.2 其他類型外泌體

多項研究分別應用了各種不同的外泌體包括突變型低氧誘導因子(HIF)-1α修飾的BMSC來源外泌體[14]、誘導性多功能干細胞來源外泌體[15]、富血小板血漿來源外泌體[16]、BMSC來源外泌體[17]治療糖皮質激素性股骨頭壞死，取得了相似且良好的效果。其原理為促進BMSC、成骨細胞、血管內皮細胞增殖，促進BMSC成骨分化及內皮祖細胞成血管分化，抵抗高糖皮質激素引起的細胞凋亡，激活細胞蛋白激酶B(Akt)/Bad/Bcl-2信號轉導通路和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K) /Akt信號轉導通路。這些不同的外泌體通過促進血管生成及骨生成方式有效阻止糖皮質激素性股骨頭壞死發(fā)生和進展。

2.3 骨缺損與骨折

目前骨缺損治療金標準是自體或異體骨移植，然而自體骨移植有創(chuàng)、來源有限，異體骨來源受限且有傳染疾病的風險。骨折和骨缺損常迫使患者長期臥床、活動受限，可能帶來一系列致死的并發(fā)癥如深靜脈血栓形成、肺栓塞等。

2.3.1 誘導性多功能干細胞來源外泌體

Qi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，誘導性多功能干細胞來源外泌體可促進去卵巢大鼠BMSC增殖及增加堿性磷酸酶(ALP)活性，上調成骨細胞相關基因RUNX-2、COL1和ALPmRNA和蛋白表達，以促進成骨細胞分化。外泌體復合β-磷酸三鈣(β-TCP)支架，可通過促進骨缺損區(qū)域血管生成和成骨加速骨缺損修復。外泌體體內外生物學效應隨著其作用濃度增加而增強。

2.3.2 脂肪干細胞來源外泌體

Chen等[19]通過慢病毒轉染使脂肪干細胞高表達miR-375并產生富含miR-375的外泌體，將該外泌體裝載在水凝膠中促進顱骨缺損模型大鼠骨再生，結果顯示miR-375能與胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)-3的 3′端非翻譯區(qū)結合，抑制IGFBP-3表達，從而促進骨再生。胰島素樣生長因子(IGF)是具有促生長作用的多肽類物質，廣泛分布于人體各種組織，IGF發(fā)揮生物學效應須先與IGFBP-3解離。

2.3.3 臍帶間充質干細胞來源外泌體

向大鼠股骨骨折區(qū)域植入結合臍帶間充質干細胞來源外泌體的水凝膠能促進血管生成和骨折愈合[20]。它不僅能增強成骨分化，還能增加血管內皮生長因子(VEGF)和 HIF-1α表達，促進內皮細胞生成血管。HIF-1α能在低氧條件下調控細胞增殖、分化，如使軟骨細胞適應骨骼生長板的低氧環(huán)境，對胚胎發(fā)育、腫瘤血管生成、傷口上皮組織修復等具有重要作用。以往研究表明，HIF-1α可促進BMSC向成骨細胞分化，改善病變部位血管生成功能，從而促進成骨和血管生成。

2.4 骨質疏松

骨質疏松的特點之一是骨量減少，其病因包括制動、服用類固醇激素、衰老、自身免疫疾病等，主要病理生理過程包括骨形成與骨吸收失衡、血管生成減少等。骨質疏松極易導致老年患者骨折并產生一系列并發(fā)癥，嚴重者可導致死亡。

2.4.1 BMSC來源外泌體

哺乳動物細胞中存在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路，其參與細胞存活、增殖和分化。成骨細胞基因表達和功能與MAPK信號轉導通路激活有關。這一通路受阻可導致骨密度下降，骨小梁體積減少，長骨皮質厚度減少，表現(xiàn)為骨質疏松。這些異常與內皮細胞減少、骨小梁形成率降低及Ⅰ型膠原、ALP、骨橋蛋白和骨鈣素-23表達減少有關。總之，MAPK信號轉導通路是調節(jié)成骨細胞生理活動的重要通路。

Zhao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，經BMSC來源外泌體處理的成骨細胞增殖增加，細胞周期S期比例增加，同時MAPK信號轉導通路相關蛋白表達也增加，說明BMSC來源外泌體可通過激活MAPK信號轉導通路促進成骨細胞增殖，BMSC來源外泌體或可用于骨質疏松的治療。

系統(tǒng)性硬化病(SSC)是一種自身免疫性疾病，這類患者除了皮膚進行性纖維化、內臟功能障礙、血管病變外，還常存在脊椎及其他骨骼骨量減少。SSC發(fā)生骨質疏松的病理生理機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在TSK/+小鼠(一種伴有股骨骨密度顯著降低和松質骨微結構異常的SSC小鼠)中下調白細胞介素-4(IL-4)/白細胞介素-4受體α(IL-4Rα)信號轉導通路可改變小鼠骨量減少情況，說明IL-4參與骨質疏松的病理生理過程[22]。Chen等[23]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC來源外泌體能將miR-151-5p轉移到TSK/+小鼠BMSC內，提高BMSC內miR-151-5p表達，繼而抑制IL-4/IL-4Rα信號轉導通路，促進BMSC成骨分化，增加礦化結節(jié)形成，上調Runx2、ALP和骨鈣素(OCN)等成骨相關蛋白表達，增加體內骨形成。

2.4.2 內皮細胞來源外泌體

內皮細胞來源外泌體較BMSC來源外泌體更具有骨靶向性和抗骨質疏松效應，內皮細胞來源外泌體可被骨髓來源的巨噬細胞內化吸收并改變其形態(tài)，并抑制破骨細胞分化和活性，降低骨吸收，從而抑制骨質疏松發(fā)生。內皮細胞來源外泌體通過其表面高表達的妊娠帶蛋白(PZP)靶向作用于骨組織，產生抗骨質疏松效應[24]。

3 展望

應用各種來源的外泌體治療OA、骨質疏松、糖皮質激素性股骨頭壞死、骨缺損、骨折等骨科常見疾病已取得了良好的成果。外泌體來源豐富，可來源于BMSC、脂肪間干細胞、SMSC、內皮細胞、胚胎干細胞、誘導多功能干細胞、富血小板血漿、樹突狀細胞、牛乳等。它的治療方式包括局部注射、全身注射、口服等。其作用機制涉及各種基因表達調控及各種信號轉導通路激活，從而調控軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、血管內皮細胞等生理活動。

值得注意的是，學者們能控制和提高各種細胞中目標miRNA表達水平，繼而將大量的目標miRNA裝載在外泌體中達到治療疾病模型的效果，充分說明外泌體的可改造性及作為基因治療藥物載體的潛力。未來外泌體研究方向可著重于提高外泌體作用的靶向性，包括利用不同外泌體表面不同膜蛋白使其靶向作用于特定組織。外泌體基礎研究尚需解決的問題包括治療效率、具體機制、安全性、治療劑量、來源及統(tǒng)一性等。