新型冠狀病毒肺炎實驗室診斷方法及意義

李紅鵬 閆雅茹 張柳 李詩琪 李慶云

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸病研究所200025

目前，全球新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情防控形勢仍相當(dāng)嚴(yán)峻，其病原體嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCo V-2)為β屬冠狀病毒的Sarbecovirus亞屬，基因與蝙蝠來源的冠狀病毒bat-SL-Co VZC45和bat-SL-covzcx21有88%同源性，與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-Co V)基因同源性約79%，但與中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERSCo V)同源性僅為50%[1-3]，邊緣有形似日冕的突起，呈圓形、橢圓形等多形性，直徑60～140 nm[4]。SARS-Co V-2具有較強(qiáng)的傳染性，尚無針對病毒的特效藥物，因此，早期準(zhǔn)確的診斷與隔離是疫情管控的關(guān)鍵。目前實驗室病原學(xué)診斷主要包括呼吸道或者血液標(biāo)本實時熒光RT-PCR的病毒核酸檢測、病毒基因測序，以及病毒抗體檢測。本文總結(jié)3種檢測方法特點和臨床意義，并介紹高通量微流控技術(shù)在COVID-19疫情防控中的應(yīng)用，以期為優(yōu)化COVID-19實驗室診斷和疫情防控提供參考。

1 核酸與抗體檢測

1.1 核酸檢測 SARS-Co V-2核酸是病毒感染后能最早檢測到的標(biāo)志物，對早診斷、早治療和疫情防控具有重大意義[5]。

1.1.1 RT-PCR核酸檢測 RT-PCR核酸檢測是診斷SARS-Co V和MERS-Co V重要的手段，具有較高的特異度和敏感度[6-7]，亦是此次診斷COVID-19最常用的實驗室檢測方法。實時熒光RT-PCR通過熒光染料或熒光探針實時監(jiān)測PCR擴(kuò)增過程，與普通PCR相比，實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，且通過熒光信號檢測代替普通電泳，極大地提高了檢測敏感度和特異度[8]。SARS-Co V-2基因組包括開放讀碼框1a/b(open reading frame 1ab，ORF1ab)、核衣殼編碼基因(nucleocapsid protein，N)、刺突編碼基因(spike protein，S)、膜蛋白編碼基因(membrane protein，M)和包膜蛋白編碼基因(envelope protein，E)[9]。檢測試劑盒基于SARS-Co V-2基因組進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，不同試劑盒的檢測原理基本一致，但因其引物、探針設(shè)計存在不同，有單靶區(qū)段(ORF1ab)、雙靶區(qū)段(ORF1ab、N或E)、三靶區(qū)段(ORF1ab、N和E)的檢測和判讀差別。比對分析研究發(fā)現(xiàn)，ORF1ab片段和N基因序列是高度保守基因區(qū)域[10]。Corman等[11]利用ORF1ab和E基因為靶標(biāo)對來自不同中心的500余份臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，均未出現(xiàn)假陽性結(jié)果，僅4例標(biāo)本起初測定為弱陽性，復(fù)測為陰性，顯示高度敏感性；研究亦發(fā)現(xiàn)ORF1ab片段和N基因與其他310份呼吸道病毒和細(xì)菌標(biāo)本之間基本無交叉反應(yīng)，提示檢測的高度特異性。因此，當(dāng)前核酸檢測主要針對ORF1ab和N編碼序列，同一份標(biāo)本中ORF1ab和N編碼序列同時陽性可即可確診，若單個靶標(biāo)陽性，則需重新采樣檢測。判別陽性標(biāo)準(zhǔn)：Ct值＜37；陰性標(biāo)準(zhǔn)：無Ct值或Ct值＞40；可疑：Ct值37～40，建議重復(fù)實驗，若重做結(jié)果Ct值＜40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，亦判斷為陽性，否則為陰性。

熒光RT-PCR技術(shù)檢測存在假陽性和假陰性問題[12]。假陽性緣于標(biāo)本間交叉污染或?qū)嶒炇覕U(kuò)增產(chǎn)物的遺留污染，在目前嚴(yán)格執(zhí)行“三個陰性樣本隨機(jī)放在臨床樣本中間同時參與檢測全過程”的質(zhì)控策略下，可有效解決。但是，RT-PCR核酸檢測陰性不能完全排除病毒感染的可能性。在此次疫情救治過程中出現(xiàn)不少假陰性病例，即出現(xiàn)臨床表現(xiàn)和CT影像提示為COVID-19，病情也在不斷發(fā)展，但核酸檢測結(jié)果為陰性，后續(xù)檢測又為陽性。假陰性原因主要涉及樣本采集的部位、時機(jī)、方法以及體外診斷試劑盒等因素。

采集的部位與方法對檢測結(jié)果存在影響。上呼吸道是病毒樣本采集最常用的部位，包括鼻咽拭子、口咽拭子和鼻咽灌洗。Lieberman等[13]比較3種方法在診斷呼吸道流感病毒、冠狀病毒和鼻病毒監(jiān)測中的敏感度，發(fā)現(xiàn)鼻咽拭子取材檢測敏感度高于口咽拭子，鼻咽灌洗取材敏感度最高；劉焱斌等[14]在對100例COVID-19患者研究中發(fā)現(xiàn)鼻拭子比口咽拭子有更高的檢測陽性率；delaTabla等[15]研究提示鼻咽-口咽拭子聯(lián)合取材對甲型流感的檢測準(zhǔn)確性優(yōu)于鼻咽灌洗取材，可提高PCR核酸檢測的陽性率。痰液和其他下呼吸道分泌物可能具有更高的病毒載荷，病例報道研究顯示3%高滲鹽霧化誘導(dǎo)排痰成功診斷咽拭子、鼻拭子多次采樣檢測陰性患者[16]；組織活檢和尸體解剖結(jié)果均顯示患者的SARS-Co V-2主要感染部位在人體下呼吸道及肺部[17-18]。

采集時機(jī)對PCR核酸陽性檢出率有影響。Thevarajan等[19]報道1例普通型COVID-19患者出現(xiàn)癥狀后4d鼻咽拭子PCR檢測病毒陽性，而發(fā)病后7dPCR病毒檢測為陰性；Young等[20]研究顯示在病情發(fā)展過程中存在鼻咽拭子PCR核酸檢測陽性和陰性交替現(xiàn)象，可能原因為SARSCo V-2感染上氣道細(xì)胞后，在機(jī)體免疫的作用下取材部位病毒載荷存在波動；Pan等[21]報道，患者在出現(xiàn)癥狀后約4～6d，咽拭子和痰液樣本中的病毒載量達(dá)到峰值，后3～4d持續(xù)轉(zhuǎn)陰，而部分患者痰液樣本中病毒載量3～5d達(dá)到峰值，之后出現(xiàn)病毒載量明顯波動，檢測陽性與陰性交替現(xiàn)象，亦提示間歇排毒現(xiàn)象和病毒載量在不同采樣時機(jī)的個體差異。

因此，當(dāng)核酸檢測陰性，但臨床高度懷疑為感染患者時，應(yīng)通過多次與多部位采樣以降低假陰性率[22]，此外，因疫情需要，已有大量核酸檢測試劑盒投入市場，但質(zhì)量參差不齊，對于懷疑假陰性的患者可合并采用2種及以上不同廠家的試劑進(jìn)行檢測和驗證，以提高診斷準(zhǔn)確性。同時樣本的采集、保存、運輸、處理過程需嚴(yán)格遵守我國《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術(shù)指南》。最后，對于PCR多次檢測陰性的高度疑似患者亦可進(jìn)行病毒基因測序和病毒抗體檢測，以提高檢測的陽性率。

1.1.2 病毒基因測序 基于二代測序技術(shù)的病原體宏基因組測序是目前臨床上最常用的測序方法，通過對臨床樣本中直接提取的DNA和/或RNA進(jìn)行高通量測序，再經(jīng)過數(shù)據(jù)庫比對與生物信息學(xué)分析，可一次性完成細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等多種病原體檢測，并提供進(jìn)一步病毒演變分析數(shù)據(jù)支持，能夠鑒別包括SARS-Co V-2在內(nèi)的冠狀病毒和其他呼吸道病原體感染，實現(xiàn)病毒序列快速檢測[23-24]。本次COVID-19疫情爆發(fā)之初，我國研究團(tuán)隊通過二代測序技術(shù)迅速對SARS-Co V-2基因組進(jìn)行鑒定分析，為疾病的診斷與疫情防控贏得寶貴時間[25]。測序技術(shù)亦可用于包括SARS-Co V-2在內(nèi)的多種呼吸道病毒的鑒別診斷和檢測病毒突變[26-27]。與熒光RT-PCR檢測技術(shù)比較，二代測序技術(shù)檢測操作復(fù)雜，檢測周期長，模型構(gòu)建數(shù)據(jù)分析難度大及經(jīng)濟(jì)成本較高等問題限制了其在疫情防控中的廣泛使用[28-29]；但二代測序策略在追蹤傳染源和了解傳染源的演變，調(diào)查疫情的傳播和傳播鏈，促進(jìn)有效和快速的分子診斷技術(shù)的研發(fā)，尋找有效治療手段和疫苗開發(fā)中具有獨特優(yōu)勢[30]；此外，對于RT-PCR核酸檢測假陰性患者，利用測序技術(shù)可進(jìn)一步確認(rèn)，以有效提高檢測結(jié)果的可靠性，并獲得是否有其他病原體感染的信息，有助于鑒別診斷[23]。

1.2 抗體檢測 據(jù)以往有關(guān)SARS-Co V的研究報道，患者血清Ig M抗體在感染急性期出現(xiàn)(感染后7d左右)，IgG抗體在感染中晚期出現(xiàn)，滴度有一個持續(xù)增高的過程，在血液循環(huán)中保持較長時間[31-32]。對SARS-Co V-2研究顯示，COVID-19患者發(fā)病第8天Ig M陽性率達(dá)100%，IgG出現(xiàn)相對較晚，發(fā)病兩周之后陽性率達(dá)88.4%[33]?？贵w檢測能簡單、快速、安全地實現(xiàn)對COVID-19患者血清、血漿和全血中的Ig M和IgG體外檢測。

SARS-Co V-2抗體檢測方法主要包括膠體金免疫層析和ELISA方法。(1)膠體金免疫層析技術(shù)肉眼可直接觀察到檢測結(jié)果，相比較現(xiàn)有的核酸檢測平臺，對技術(shù)和人員要求均較低，加樣后15min即可觀察到結(jié)果，實現(xiàn)對疑似患者進(jìn)行現(xiàn)場檢測與篩查，尤其適合于現(xiàn)場快速檢測，但特異度、敏感度相對于核酸檢測較弱[34-35]。(2)ELISA抗體檢測適用于對疑似患者或者密切接觸人群進(jìn)行快速批量檢測，以及抗體滴度測定。但此方法檢測速度慢，步驟繁瑣，限制了其在COVID-19爆發(fā)流行時的應(yīng)用。

SARS-Co V-2抗體檢測可與核酸檢測實現(xiàn)互補(bǔ)。徐萬洲等[36]對205例COVID-19確診患者和79例非COVID-19人群進(jìn)行血清SARS-Co V-2抗體檢測的研究發(fā)現(xiàn)，血清Ig M和IgG對COVID-19診斷的敏感度分別為70.24%(144/205)和96.10%(197/205)，臨床特異度分別為96.20%(76/79)和92.41%(73/79)；與核酸檢測相比，抗體檢測具有較低的陽性預(yù)測值(95.63%比100%)，但具有較高的陰性預(yù)測值(91.03%比80.61%)；研究亦發(fā)現(xiàn)抗體檢測能將94.74%(18/19)的核酸假陰性的COVID-19患者確診。因此，對于核酸檢測假陰性的患者，病毒核酸檢測聯(lián)合血清抗體檢測有助于提高檢測的準(zhǔn)確性。

SARS-Co V-2抗體檢測在疫情防控中具有重要意義。IgG出現(xiàn)較晚，但可在康復(fù)患者中持續(xù)存在，因此可用以回顧性分析特定人群的COVID-19的流行病學(xué)情況。IgG亦是病毒重要的特異性保護(hù)性抗體，其滴度高低與康復(fù)患者抗病毒能力相關(guān)，高滴度人群可從事病毒防疫工作或者貢獻(xiàn)康復(fù)期血漿[37]。同時需注意，抗體檢測易受血液標(biāo)本中一些干擾物質(zhì)(如類風(fēng)濕因子、非特異Ig M、溶血所致的高濃度血紅蛋白等)的影響而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。此外，在抗體產(chǎn)生的窗口期可出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。

2 新技術(shù)在病毒核酸檢測中的應(yīng)用

近年來，各種新技術(shù)用于病毒核酸檢測，如巢式PCR、納米孔測序、基因芯片技術(shù)、恒溫逆轉(zhuǎn)錄、熒光納米探針等，提高檢測效率，簡化檢測步驟。微流控技術(shù)被稱為芯片上實驗室，是將包括上述檢測技術(shù)在內(nèi)的多種技術(shù)靈活組合和規(guī)模集成在微小而可控的平臺上，最大限度把實驗室的功能轉(zhuǎn)移到便攜的、方寸大小芯片上，具有高通量、即時性、集成化、自動化、低成本便于攜帶的特點，1h內(nèi)即可完成現(xiàn)場檢測[38]。有助于在疫情爆發(fā)期進(jìn)行批量、快速和現(xiàn)場檢測，促進(jìn)SARS-Co V-2感染患者的快速篩選、確診和分流，避免集中檢測造成的醫(yī)療資源嚴(yán)重透支。

微流控檢測技術(shù)有望實現(xiàn)SARS-Co V-2核酸快速擴(kuò)增檢測和病毒的鑒別診斷。將核酸快速提取、恒溫逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增、便攜式實時熒光檢測和比色檢測3個關(guān)鍵技術(shù)，整合于微流控芯片系統(tǒng)，一套系統(tǒng)可實現(xiàn)多人份樣本平行檢測(近3000人份/d)，極大提高檢測效率[39]。呼吸道病原體超20種，傳統(tǒng)的PCR技術(shù)僅能對樣本病原體進(jìn)行逐一擴(kuò)增，微流控芯片內(nèi)部集成的高通量恒溫核酸擴(kuò)增模塊分析系統(tǒng)具有大規(guī)模并行式微反應(yīng)元件，可一次對同一樣本進(jìn)行多病毒檢測[40]。目前，相應(yīng)的微流控檢測統(tǒng)已成功研發(fā)，能夠在1h內(nèi)鑒定出多種病原體，包括季節(jié)性流感病毒、禽流感、合胞病毒、SARS-Co V、MERS-Co V和SARSCo V-2，但其檢測的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步評估。

空氣傳播是COVID-19最主要的傳播途徑，對空氣病毒載荷檢測有助于疫情防控。目前傳統(tǒng)的空氣微生物檢測技術(shù)(落板培養(yǎng)法和安德森采樣器法)敏感度較低且花費時間長，無法滿足實時快速的應(yīng)急處置需求。Jiang等[41]和Jing等[42]利用微流控技術(shù)將空氣中病原體的捕獲、富集、檢測、鑒定整合在同一檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)3h內(nèi)對公共場所空氣中多種病原體的檢測。顯然基于同樣原理，包括COVID-19在內(nèi)呼吸道多種病毒的高通量、全自動實時監(jiān)測的分析系統(tǒng)的研發(fā)將有助于重點公共區(qū)域空氣衛(wèi)生防疫工作的有效實施。

3 小結(jié)與展望

SARS-Co V-2作為一種新型高傳染性病毒，實驗室檢測能力能否滿足疫情需求成為極大的挑戰(zhàn)，病毒核酸檢測廣泛應(yīng)用，操作相對復(fù)雜，需在P2級實驗室進(jìn)行；抗體檢測操作簡單易于推廣，可與核酸檢測實現(xiàn)互補(bǔ)，提高診斷陽性率，但不利于早期診斷。高通量、高自動化、高集成的技術(shù)開發(fā)和應(yīng)用對此次和未來疫情防控意義重大。相對于傳統(tǒng)檢測技術(shù)，將SARS-Co V-2核酸檢測方法與微流控技術(shù)結(jié)合，有望實現(xiàn)病毒的快速高通量診斷與鑒別診斷，值得推廣。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突