牙體組織粘接界面觀察分析方法的研究進(jìn)展

馬超群， 劉猛， 仇珺， 廖紫璇， 周唯， 陳吉華

1. 口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心 軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，陜西 西安（710032）； 2. 口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心 軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西 西安（710032）

隨著口腔粘接修復(fù)技術(shù)的發(fā)展，牙科粘接技術(shù)與材料已被廣泛應(yīng)用于牙科治療的各個領(lǐng)域。粘接效果的評價包括臨床觀察和實(shí)驗(yàn)室檢測兩部分，實(shí)驗(yàn)室檢測中對粘接修復(fù)材料與牙體硬組織結(jié)合界面的觀察分析是評價粘接效果的重要手段。根據(jù)研究目的不同，學(xué)者們開發(fā)出了多種用于粘接界面形貌性能觀察分析的方法。牙體組織粘接界面的觀察分析主要借助于各種顯微鏡。而在具體的檢測中，顯微鏡的功能又不僅限于一般的形貌觀察，還可以對物質(zhì)的成分結(jié)構(gòu)生物活性等進(jìn)行檢測，甚至有些顯微鏡成像原理即為物質(zhì)成分差異。根據(jù)對相關(guān)文獻(xiàn)的收集與整理，將目前最常用的粘接界面觀察分析的方法按照顯微鏡類型進(jìn)行了分類敘述，其中也包括基于顯微鏡觀察的其他分析方法，如下。

1 掃描電子顯微鏡（scanning electron micrographs，SEM）

SEM 是一種通過收集電子束與試樣表面作用產(chǎn)生的信號生成圖像以達(dá)到對試樣表面形貌呈現(xiàn)的方法。電子束可使試樣5～10 nm 厚度的表層電離逸出大量二次電子。試樣某部位二次電子的產(chǎn)額與試樣表面的凹凸形貌以及成像的亮度正相關(guān)［1］。所以普通模式下的SEM 圖像特點(diǎn)為凸出的地方亮度高而凹陷的地方亮度低［2］。入射電子也有一部分會被試樣50～100 nm 厚度的表層反射成背散射電子。試樣某部位背散射電子的產(chǎn)額與該部位元素的原子序數(shù)高度成正相關(guān)。所以背散射模式下的SEM 圖像特點(diǎn)為元素原子序數(shù)高的區(qū)域亮度高，而原子序數(shù)低的區(qū)域亮度低［3］。這種模式適用于粘接界面納米滲漏的觀察，因?yàn)榭梢燥@示銀離子的位置［4?5］。然而背散射模式下的SEM 成像分辨率要低于普通模式。

SEM 觀察樣本的制作分為兩步。第一，粘接試件制作，按照需求制備相應(yīng)的粘接樣本，并通過切割或其他方法形成適當(dāng)?shù)男螒B(tài)；第二，電鏡樣本制作，根據(jù)需求樣本可經(jīng)過或不經(jīng)過固定、脫礦、脫膠原、超聲清洗、表面拋光、梯度脫水等處理，最后進(jìn)行噴金。SEM 觀察深度較淺，其樣本制作對表面處理要求較高，但樣本表面經(jīng)過切割會產(chǎn)生玷污層從而影響觀察。對于切割產(chǎn)生觀察面的樣本就需要去除玷污層，可以采用高度拋光或表面酸蝕的方法，或者根據(jù)需要僅保留部分結(jié)構(gòu)，如用磷酸鹽及次氯酸去除全部牙體組織而僅保留樹脂結(jié)構(gòu)［6?7］。抗酸堿層則可能需要更為負(fù)責(zé)的樣本表面處理方法［8］。

SEM 界面形態(tài)景深、視野大，立體效果好，能夠比較清晰地反映牙本質(zhì)膠原纖維和樹脂的位置關(guān)系。此外還可利用SEM 相配套的X 線能譜儀（X?ray energy dispersive analysis，EDS）對界面結(jié)構(gòu)的元素組成進(jìn)行深入分析；但表面處理可能難以保證界面結(jié)構(gòu)完全不受損傷。此外，在真空干燥環(huán)境中觀察會引發(fā)材料及組織收縮，產(chǎn)生裂縫影響觀察效果。針對干燥的問題也可用環(huán)境掃描電鏡（environmental scanning electron microscope，ESEM）進(jìn)行觀察，但ESEM 分辨率不及SEM，使用仍具有一定局限性［9］。

2 透射電子顯微鏡（transmission electron micro?scope，TEM）

TEM 是一種通過收集電子束透過試樣后的電子信息，生成圖像以達(dá)到試樣微觀結(jié)構(gòu)與成分分析的方法。TEM 觀察試樣通常為80～100 nm 的超薄切片［10］。TEM 較SEM 有更高分辨率，可觀察到試樣內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)，在粘接界面觀察中常應(yīng)用于牙本質(zhì)和混合層中膠原和礦物質(zhì)或粘接樹脂之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系和界面納米滲漏的分析。

TEM 觀察樣本粘接制樣較SEM 復(fù)雜，需進(jìn)行脫礦處理，并經(jīng)過多重固定，梯度脫水，包埋，染色和超薄切片等步驟。TEM 觀察深入物質(zhì)內(nèi)部，可顯示界面的超微結(jié)構(gòu)，將樹脂、膠原、礦物質(zhì)的二維結(jié)構(gòu)關(guān)系顯示較為清晰［9］。但與SEM 相比，TEM無法反映界面的立體結(jié)構(gòu)，且由于是超薄切片，樣本制作的精細(xì)程度會對觀察效果產(chǎn)生明顯影響。

3 激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning mi?croscopy，CLSM）

CLSM 是一種在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計算機(jī)進(jìn)行圖象處理，使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針得到物質(zhì)內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的方法。其所得圖像是標(biāo)本的光學(xué)橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點(diǎn)［11］。

存在于粘接界面的能被探測到的熒光信號分為兩類。一類是外源性熒光，即熒光染料及熒光反應(yīng)所形成的熒光信號；另一類是內(nèi)源性熒光，即自發(fā)熒光。外源性熒光根據(jù)觀察目的不同有多種形式：①染料標(biāo)記界面結(jié)構(gòu)，即在粘接制樣過程中將熒光染料與粘接材料混合形成熒光標(biāo)記的粘接材料，觀察時熒光可顯示粘接劑的位置，通過熒光信號反映粘接界面的形貌［12］；②染料滲透，即將粘接樣本浸入熒光染料溶液中，染料會進(jìn)入封閉性差的界面滲漏位置，實(shí)現(xiàn)對界面完整性的評估［13］；③熒光反應(yīng)，當(dāng)發(fā)生特異性反應(yīng)時，原本淬滅狀態(tài)的熒光劑被激活來探測目標(biāo)物質(zhì)在粘接界面的分布情況。如粘接界面原位酶譜檢測，即將淬滅狀態(tài)的熒光標(biāo)記明膠溶液滴加在粘接試件上進(jìn)行孵育，明膠酶活性增強(qiáng)時淬滅狀態(tài)的熒光標(biāo)記明膠被水解產(chǎn)生熒光信號，從而對粘接界面膠原破壞情況進(jìn)行研究［14］。此外，還可利用死/活菌熒光染色試劑，對粘接界面內(nèi)及下方牙體組織中細(xì)菌進(jìn)行染色，觀察致齲菌對粘接界面的破壞情況［15］。

內(nèi)源性熒光則是粘接界面各物質(zhì)結(jié)構(gòu)在CLSM 激發(fā)光源的照射下所產(chǎn)生的熒光信號。據(jù)相關(guān)研究，健康及脫礦牙本質(zhì)、粘接劑、復(fù)合樹脂、粘接劑混合層等都能發(fā)出不同強(qiáng)度的自發(fā)熒光信號，從而用于對界面不同結(jié)構(gòu)的區(qū)分，可對粘接界面的破壞程度、早期齲等進(jìn)行觀測［16?17］。

CLSM 樣本制備簡便，水不影響CLSM 掃描，可對正常濕度的試樣觀察，能保持樣本的原始狀態(tài)。CLSM 還可對樣本表面下一定深度的地方進(jìn)行掃描，通過計算機(jī)重建獲得三維圖像。但外源性熒光可能會因?yàn)橹茦舆^程產(chǎn)生一定的誤差，如染料的外溢或混合不均勻。內(nèi)源性熒光能夠在一定程度上避免外源性染色所產(chǎn)生的誤差，但是作為一種新的觀察方法還有待研究。

4 拉曼光譜（raman spectroscopy，RS）

RS 作為一種分子振動譜線，其觀察原理為拉曼散射和拉曼位移。不同化學(xué)鍵或基團(tuán)特有的分子振動能產(chǎn)生特異性拉曼位移。在拉曼光譜的結(jié)果圖中，X 軸代表拉曼位移，對應(yīng)化學(xué)基團(tuán)；Y 軸代表峰強(qiáng)度，和基團(tuán)濃度呈正比。不同材料有特征性的拉曼光譜，可用于定性反映物質(zhì)的組分和結(jié)構(gòu)信息［18］。

常規(guī)粘接界面觀察樣本因切割會產(chǎn)生玷污層而影響RS 的定性分析。此時可通過高度拋光或酸蝕劑去除玷污層以增加拉曼分析的準(zhǔn)確性。清除表面玷污層后便可直接進(jìn)行觀察，無需干燥。當(dāng)檢測靠近交界處的牙本質(zhì)，若觀測到樹脂成分特征峰和牙體組織特征峰同時出現(xiàn)，證明樹脂已經(jīng)滲入牙本質(zhì)小管。此外，若以特征峰為峰強(qiáng)熱度值，可顯示不同結(jié)構(gòu)成分在粘接界面的分布［19］。雖然RS 不是一種嚴(yán)格意義上的定量檢測手段，但可通過與正常牙本質(zhì)及樹脂的譜圖進(jìn)行對比，分析粘接劑對牙本質(zhì)表面改造程度［3］。

相比于SEM 和TEM，RS 可通過分析化學(xué)成分變化精確反映界面結(jié)構(gòu)，并可實(shí)現(xiàn)對粘接界面的多點(diǎn)連續(xù)監(jiān)測，獲得較為準(zhǔn)確的界面結(jié)構(gòu)成分變化情況［20?21］。

5 光學(xué)相干層析成像（optical coherence tomogra?phy，OCT）

OCT 通過光源的低相干光干涉原理和圖像處理技術(shù)的融合，分析組織對光源產(chǎn)生的背向散射光和另一束光源產(chǎn)生的干涉光得到樣品在不同深度的結(jié)構(gòu)信息［22］。

在牙科領(lǐng)域，OCT 被首先用于對齲壞組織的觀察，齲壞脫礦部位的信號強(qiáng)度灰度較周圍正常牙本質(zhì)高［23］。近年來，OCT 對粘接界面的觀察主要集中于對界面微滲漏的分析。用于填充缺陷的介質(zhì)和材料主體之間的光學(xué)對比度，會導(dǎo)致反向散射信號的可檢測變化。作為缺陷區(qū)域，微滲漏的光學(xué)散射強(qiáng)度與其他部分有明顯差異，在OCT 圖像中，界面微滲漏表現(xiàn)為明顯的灰度增強(qiáng)區(qū)域。此外界面或其他位置出現(xiàn)如氣泡等較大缺陷，OCT圖像中則表現(xiàn)為灰度減小的信號中斷區(qū)域［24］。

OCT 成像具有非接觸性、無損傷性、成像速度快等優(yōu)點(diǎn)，觀測不受水分影響。由于不需要切割，樣本可反復(fù)使用，從而最大限度消除粘接耐久性檢測中由樣本誤差帶來的干擾。但由于組織自身導(dǎo)致的光學(xué)衰減，大多數(shù)組織中的OCT 成像深度在2～3 mm。OCT 的分辨率較低，難以對粘接界面的細(xì)微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

6 原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）

AFM 通過探針與物體表面結(jié)構(gòu)發(fā)生力學(xué)作用，重現(xiàn)物體表面細(xì)微結(jié)構(gòu)。其納米級探針和微米級懸臂是成像的關(guān)鍵［25］，在測量時須注意對樣本表面機(jī)械性能進(jìn)行預(yù)估以選擇適合的探針，對機(jī)械性能差異較大的不同結(jié)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)檢測時，也須及時更換探針以獲得準(zhǔn)確的測量結(jié)果，同時也避免儀器的損傷。其工作模式有接觸、非接觸和輕敲模式，牙本質(zhì)粘接界面的結(jié)構(gòu)分析常用輕敲模式。樣品制作時僅需按照說明進(jìn)行。觀測面必須平整，因?yàn)锳FM 只能處理表面一定高度變化，否則會產(chǎn)生低質(zhì)量圖像甚至損壞探針。盡量保證拋光等制備技術(shù)的質(zhì)量，從而可獲取最大分辨率［26］。

AFM 的輕敲模式可清晰地觀測到樹脂層、混合層、牙本質(zhì)層、牙本質(zhì)小管以及樹脂突等結(jié)構(gòu)［27］。除觀測形貌外，AFM 還可通過對表面形貌進(jìn)行三維分析，實(shí)現(xiàn)對牙本質(zhì)小管直徑、深度以及表面粗糙度的測量［28］。這種直接測量得到的表面粗糙度可用于酸對牙釉質(zhì)的侵蝕程度和粘接劑附著力的分析［26，29］。此外，AFM 與納米硬度計聯(lián)合使用可用于樣本表面納米機(jī)械性能的檢測，表面不同部位的力學(xué)性能差異以熱度值表示，分辨率可達(dá)納米級［30］。AFM 在牙齒硬組織表面結(jié)構(gòu)形貌及性能分析中具有廣泛應(yīng)用。在粘接界面觀測上，可盡量保存牙齒原貌，排除人為因素干擾，也不會受到樣品表面水膜和殘留的黏性粘接劑的影響，其多種模式也可適應(yīng)不同環(huán)境。

7 小 結(jié)

以上6 種為目前評估粘接界面質(zhì)量的最常用方法。SEM 在界面形貌觀察中最為常用；對于超微結(jié)構(gòu)的觀察，如牙本質(zhì)膠原、牙釉質(zhì)釉柱晶體的觀察，則必須使用SEM 或TEM 這種高分辨率的顯微鏡；CLSM 常借助外源性染色對粘接材料在牙體組織中的分布及形態(tài)進(jìn)行觀察；納米滲漏檢測中SEM 與TEM 均使用較多；微滲漏可用CLSM 熒光染料滲透法進(jìn)行檢測；OCT 在微滲漏檢測中也有著良好的應(yīng)用前景；對于界面結(jié)構(gòu)成分的分析，可通過SEM 中的EDS 進(jìn)行元素檢測，也可使用RS 對特征化學(xué)鍵和基團(tuán)進(jìn)行分析；粘接界面的物理特性，如機(jī)械性能、表面粗糙度則可通過AFM 及相應(yīng)設(shè)備進(jìn)行檢測。

【Author contributions】Ma CQ，Liu M wrote the article. Qiu J，Li?ao ZX collected the data. Zhou W，Chen JH revised the article. All au?thors read and approved the final manuscript as submitted.