鹿藥抗真菌有效部位篩選及其作用機(jī)制研究

劉 偉，趙然然，張夢莎，羅凱英，龐廷松，趙鵬帥，周翼鵬

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院 藥學(xué)系,陜西 西安 710021；2.空軍軍醫(yī)大學(xué) 藥學(xué)院 藥化和藥分教研室,陜西 西安 710032)

0 引言

鹿藥(SmilacinajaponicaA.Gray)為百合科(Liliaceae)鹿藥屬(Smilacina Desf)多年生草本植物，廣泛分布于我國西北、西南、東北和華北等地，生于林下陰濕處或巖縫中，資源較豐富.鹿藥地上部分是可食用的山野菜，其干燥根莖及根為我國民間常用中藥[1-3].據(jù)《千金·食治》記載，鹿藥性味“甘苦溫，無毒，具有補(bǔ)氣益腎、祛風(fēng)除濕和活血調(diào)經(jīng)的功效，可用于治療風(fēng)濕骨痛、神經(jīng)性頭痛、乳腺炎、月經(jīng)不調(diào)、癰癤腫毒和跌打損傷等病癥.鹿藥還有潤肺養(yǎng)陰、健脾、祛痰止血和清腫解毒的作用，也可治療咳嗽、崩漏、體虛、吐血、咽喉腫痛和瘡毒等癥”[4].

現(xiàn)代藥理研究表明，鹿藥具有抗細(xì)菌、抗腫瘤和抗氧化等作用[4-8].前期本課題組首次研究報(bào)道鹿藥的乙醇粗提物對各種真菌表現(xiàn)較好的廣譜、殺真菌活性，初步的機(jī)制探索研究發(fā)現(xiàn)鹿藥粗提物的抗真菌活性可能與增加細(xì)胞膜通透性，破壞真菌細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)有關(guān)[9].但鹿藥抗真菌的具體有效部位或成分還不清楚，其作用機(jī)制亦不明確，因此本文研究了鹿藥不同極性的溶劑萃取部位對各種真菌的作用，以及對真菌細(xì)胞壁的影響，為進(jìn)一步研究鹿藥抗真菌活性物質(zhì)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 主要材料和試劑

鹿藥購于德爾康醫(yī)藥連鎖(槐芽第四連鎖店).將藥材粉碎，稱取5 g粉末，按料液比1∶20加100 mL 75%乙醇，冷凝回流提取2 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成浸膏.加水溶解后分別用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取三次，濃縮后分別得浸膏，均用二甲基亞砜(DMSO)配成儲(chǔ)備液濃度均為0.333 g/mL，分裝，-20 ℃保存待用.

乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜均為分析純；阿尼芬凈，MCE公司，批號011155125；兩性霉素B(AmB)，Acros公司，批號P1434922；氟康唑(FCZ)，Sigma公司，批號036M4709V.

真菌菌種包括：白念珠菌SC5314、耐藥白念珠菌103、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌和新生隱球菌，均惠贈(zèng)于上海市長海醫(yī)院檢驗(yàn)科.

1.1.2 主要儀器

GHP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；THZ-98C型恒溫震蕩箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SW-CT-IF型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國卡爾蔡司)；多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司，芬蘭).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微量液基稀釋法

挑取菌克隆少量，接種至YPD 培養(yǎng)液，35 ℃，200 rpm 振蕩培養(yǎng)，使真菌處于指數(shù)生長期后期.以RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度至103個(gè)/mL.取無菌96孔板，使各孔的最終藥物濃度分別呈現(xiàn)倍比濃度減少，孔中DMSO含量均低于1%.每次配制藥敏板的同時(shí)均制備一質(zhì)控菌藥敏板，各藥敏板于35 ℃恒溫箱培養(yǎng).培養(yǎng)24 h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并確定其最低抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值[10].

1.2.2 生長實(shí)驗(yàn)

將耐藥白念珠菌SC5314、103、新生隱球菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌至液體YPD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，PBS 洗滌，調(diào)整菌濃度至1.0×106cells/mL.加不同濃度的正丁醇部位(104μg/mL、208μg/mL、416μg/mL)、石油醚部位(416μg/mL)、乙酸乙酯部位(416μg/mL)、水部位(416μg/mL)作用24 h后拍照[9].

1.2.3 時(shí)間-殺菌曲線實(shí)驗(yàn)

將白念珠菌SC5314克隆至液體YPD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜.離心收集菌體，PBS 洗滌，RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整菌濃度至1.0×105cells/mL，加不同濃度的正丁醇部位(104μg/mL、208μg/mL、416μg/mL)、石油醚部位(416μg/mL)、乙酸乙酯部位(416μg/mL)、水部位(416μg/mL).將菌液分裝50 mL離心管中，振搖培養(yǎng)，于不同時(shí)間點(diǎn)(0、6 h、12 h、24 h)取出菌液，用PBS稀釋不同的濃度，分別涂鋪SDA平板，35 ℃，靜置培養(yǎng)48 h后，數(shù)克隆數(shù)并計(jì)算CFU/mL數(shù)目[9].

1.2.4 生物被膜實(shí)驗(yàn)

將白念珠菌SC5314克隆于YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后，RPMI1640 培養(yǎng)基調(diào)整菌濃度至1.0×106cells/mL.菌懸液100μL加入96孔板，37 ℃粘附90 min后，PBS洗3次，再加入新鮮PRMI 1640或者含藥的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用XTT(0.5 mg/mL)/甲萘醌(1μM)孵育3 h，用多功能酶標(biāo)儀檢測波長為495 nm的吸收值.成熟生物被膜的檢測：1.0×106cells/mL菌懸液100μL加入96孔板，37 ℃粘附90 min后，PBS洗3次，再加入新鮮PRMI 1640 37 ℃培養(yǎng)24 h后，PBS洗3次，加含藥的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用XTT(0.5 mg/mL)/甲萘醌(1μM)孵育3 h，用多功能酶標(biāo)儀檢測波長為495 nm的吸收值[11].

1.2.5 棋盤式微量液基稀釋法

棋盤式微量稀釋法是微量液基稀釋法的延伸，即合用的兩種藥物于96孔板上以二維棋盤的縱(A至H)橫(2至11)兩方向分別進(jìn)行二倍的倍比稀釋.例如鹿藥正丁醇部位與另一種抗真菌藥物兩性霉素B合用后，使得兩性霉素B的終濃度為4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.063μg/mL、0.031μg/mL、0.016μg/mL、0.008μg/mL，鹿藥正丁醇的終濃度為104μg/mL、52μg/mL、26μg/mL、13μg/mL、6.5μg/mL.與鹿藥正丁醇合用的其他抗真菌藥物阿尼芬凈的終濃度為：1μg/mL至0.002μg/mL.

部分抑菌濃度指數(shù)(Fractional Inhibitory Concentration Index，F(xiàn)ICI)是評價(jià)聯(lián)合用藥的兩藥相互作用方式的主要參數(shù).抑菌濃度分?jǐn)?shù)(FIC)，分別為每一種藥物聯(lián)合抑菌時(shí)所需MIC與單用時(shí)MIC的比值.而FICI指數(shù)則等于兩種藥物FIC之和.當(dāng)MIC值高于檢測最高限時(shí)以最高限濃度的兩倍值用以計(jì)算FICI.當(dāng)FICI≤0.5時(shí)兩藥的相互作用確定為協(xié)同作用，且FICI指數(shù)越小，協(xié)同作用越強(qiáng)；0.54時(shí)兩藥產(chǎn)生拮抗作用[10].

1.2.6 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(CCK-8法)

96孔板每孔加入濃度為8×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液100μL，即8 000個(gè)細(xì)胞/孔，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi).24 h后，上層培養(yǎng)液吸掉，加入含有不同濃度的鹿藥正丁醇部位(6 660μg/mL、3 330μg/mL、1 665μg/mL、832μg/mL、417μg/mL、208μg/mL)的培養(yǎng)液，100μL/孔，37 ℃作用48 h.每孔加入CCK-8 10μL，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，作用1 h后，用多功能酶標(biāo)儀測OD470nm值.

1.2.7 點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)

挑取白念珠菌克隆于1 mL YPD中，35 ℃，200 rpm培養(yǎng)使其菌處于對數(shù)生長期，重懸于新鮮PRMI 1640，使菌濃度為1×106CFU/mL，加鹿藥正丁醇部位(濃度為1/2MIC、MIC、2MIC)，35 ℃，200 rpm培養(yǎng)1 h.5 000 rpm離心2 min收集，PBS渦旋混勻，重復(fù)清洗三次，PBS重懸，通過顯微鏡計(jì)數(shù)法調(diào)整菌濃度為1×107CFU/mL，按照5倍梯度稀釋菌濃度，分別取3μl菌液點(diǎn)于YPD平板或YPD添加15μg/mL熒光素白(CFW)，30μg/mL剛果紅，2μg/mL 氟康唑(FCZ)，0.5μg/mL 兩性霉素B(AmB)，25 ng/mL的阿尼芬凈，平板放于35 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)，拍照[12].

1.2.8 激光共聚焦實(shí)驗(yàn)

挑取白念珠菌克隆于1 mL YPD中，35 ℃，200 rpm培養(yǎng)至菌處于對數(shù)生長期，PBS渦旋混勻，5 000 rpm離心2 min，重復(fù)清洗三次，再用0.5 mL PBS重懸，將菌液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，加入CFW使其終濃度為50μg/mL，渦旋混勻，用錫箔紙包裹EP管避光，置于30 ℃培養(yǎng)箱，120 rpm震蕩培養(yǎng)30 min.5 000 rpm離心2 min，去上清，PBS重復(fù)清洗3次，用PBS重懸，并通過顯微鏡計(jì)數(shù)方法調(diào)整菌濃度，取80μL于粘附載玻片上，避光靜置通風(fēng)，吹干，滴80%甘油10μL，蓋上蓋玻片，用錫箔紙將制片包被，放于4 ℃冰箱待用.激光共聚焦顯微鏡觀察熒光(63×油鏡，激發(fā)光405 nm)，拍照[12].

2 結(jié)果與討論

2.1 鹿藥不同萃取部位對各種真菌的MIC值

由表1可知，正丁醇部位對7種真菌(白念珠菌SC5314、耐藥白念珠菌103、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、新生隱球菌)的MIC值最小，對這7種真菌的MIC值范圍為104～832μg/mL，而石油醚部位對這7種真菌的MIC值最高，MIC值范圍為3 330μg/mL至大于3 330μg/mL；乙酸乙酯、水的部位次之，對7種真菌的MIC值范圍為832μg/mL至大于3 330μg/mL.這結(jié)果說明鹿藥正丁醇部位對7種真菌有較優(yōu)的抗真菌活性，可能是鹿藥發(fā)揮抗真菌活性的主要部位.

表1 鹿藥不同萃取部位對各種真菌的MIC值 (μg/mL)

2.2 鹿藥不同萃取部位對真菌生長的影響

由圖1可知，當(dāng)濃度為1/2MIC、MIC、2MIC的正丁醇部位作用各種真菌24 h后，6種真菌(敏感白念珠菌SC5314、氟康唑耐藥白念珠菌103、新生隱球菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌)的培養(yǎng)液均保持不同程度的澄清，其中5種真菌(敏感白念珠菌SC5314、氟康唑耐藥白念珠菌103、新生隱球菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌)在濃度為1/2MIC、MIC、2MIC的正丁醇部位作用后，菌液仍保持澄清狀態(tài)，這說明正丁醇部位對6種真菌(敏感白念珠菌SC5314、氟康唑耐藥白念珠菌103、新生隱球菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌)均有抑制作用，其中對敏感白念珠菌SC5314、氟康唑耐藥白念珠菌103、新生隱球菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌的抑制作用更優(yōu).

圖1 鹿藥正丁醇部位對6種真菌生長的作用

2.3 鹿藥不同萃取部位對真菌的時(shí)間-殺菌曲線

由圖2可知，不同濃度的正丁醇部位(208μg/mL、416μg/mL)作用白念珠菌6 h后，存活菌落數(shù)均為0，且在12 h，24 h，三個(gè)濃度正丁醇部位組(104μg/mL、208μg/mL、416μg/mL)均無存活菌落數(shù)，而其他鹿藥萃取部位(石油醚、乙酸乙酯、水)作用24 h后的存活菌落數(shù)與空白組無差異.這結(jié)果表明：鹿藥正丁醇部位對白念珠菌具有較好的殺菌活性，且是鹿藥發(fā)揮殺菌活性的主要有效部位.

圖2 鹿藥不同萃取部位對真菌的時(shí)間-殺菌曲線

2.4 鹿藥正丁醇部位對真菌生物被膜的影響

由圖3(a)可知，當(dāng)鹿藥正丁醇部位在濃度為26μg/mL時(shí)，對生物被膜的形成表現(xiàn)明顯的抑制作用(P<0.05)，且隨著濃度的增加，其抑制生物被膜形成能力亦逐漸增加.由圖3(b)可知，鹿藥正丁醇部位在較高濃度(1 665μg/mL、3 330μg/mL、6 666μg/mL)時(shí)，對成熟生物被膜具有明顯的損傷作用(P<0.01).這說明鹿藥正丁醇部位能明顯的抑制生物被膜的形成，且在較高濃度時(shí)對成熟生物被膜也有一定的損傷作用.

(a)生物被膜的形成

2.5 鹿藥正丁醇部位對正常細(xì)胞存活的影響

如圖4所示，417μg/mL和208μg/mL鹿藥正丁醇部位分別作用人胚腎293T細(xì)胞48 h后，細(xì)胞存活百分率分別為87.7±9.1%和84.0±4.9%.這結(jié)果表明：在正丁醇部位濃度為抗真菌的MIC(208μg/mL)和2MIC值(417μg/mL)時(shí)對正常細(xì)胞毒性較小.

圖4 鹿藥正丁醇部位對人胚腎293T細(xì)胞存活的影響

2.6 鹿藥正丁醇部位與抗真菌藥物的聯(lián)合抗真菌作用

由表2可知，鹿藥正丁醇部位與阿尼芬凈合用后，對4種真菌(敏感和耐藥白念珠菌、熱帶念珠菌和新生隱球菌)的敏感性均增加.阿尼芬凈單用時(shí)對白念珠菌SC5314和103的MIC值分別為0.125μg/mL和0.063μg/mL，鹿藥正丁醇部位MIC值均為416μg/mL.兩藥合用后，阿尼芬凈的MIC值分別下降到0.031μg/mL和0.008μg/mL，鹿藥正丁醇部位下降至52μg/mL和26μg/mL，同樣地，阿尼芬凈單用時(shí)對熱帶念珠菌MIC值為1μg/mL，鹿藥正丁醇部位MIC值為1 560μg/mL.兩藥合用后，阿尼芬凈的MIC值下降到0.125μg/mL，鹿藥正丁醇部位下降至52μg/mL.兩藥合用對這四種菌的FICI值范圍為0.157～0.315，均<0.5，提示鹿藥與阿尼芬凈具有協(xié)同抗真菌活性.

表2 鹿藥正丁醇有效部位與阿芬尼凈合用對真菌的MIC值 (μg/mL)

由表3可知，鹿藥正丁醇萃取物與兩性霉素B合用后，對3種真菌(敏感白念珠菌5314、熱帶念珠菌和新生隱球菌)的敏感性均增加.兩性霉素B單用時(shí)對白念珠菌SC5314和103、新生隱球菌的MIC值均為0.25μg/mL，鹿藥正丁醇萃取物MIC值均為416μg/mL.兩藥合用后，兩性霉素B的MIC值分別下降到0.063μg/mL、0.125μg/mL和0.031μg/mL，鹿藥正丁醇萃取物下降至52μg/mL，同樣的，兩性霉素B單用時(shí)對熱帶念珠菌MIC值為0.5μg/mL，鹿藥正丁醇萃取物MIC值為1 560μg/mL.兩藥合用后，兩性霉素B的MIC值下降到0.125μg/mL，鹿藥正丁醇萃取物下降至52μg/mL.兩藥合用對白念珠菌5314、熱帶念珠菌和新生隱球菌的FICI值范圍為0.25～0.375，均<0.5，提示鹿藥與兩性霉素B具有協(xié)同抗真菌活性.對耐藥白念珠菌103，F(xiàn)ICI值為0.625，提示鹿藥與兩性霉素B兩藥合用表現(xiàn)相加作用.

表3 鹿藥正丁醇部位與兩性霉素B合用對真菌的MIC值(μg/mL)

2.7 鹿藥正丁醇部位作用后的真菌對各種藥物刺激的敏感性

由圖5可知，與對照組——正常YPD平皿相比，鹿藥正丁醇作用后的真菌在含阿尼芬凈、剛果紅、熒光素白、兩性霉素B的平皿上的真菌存活數(shù)量減少甚至無菌存活，在含氟康唑藥物的平皿上真菌存活數(shù)量與空白組相比無差異.從以上結(jié)果可知：鹿藥的正丁醇部位作用后的真菌對細(xì)胞壁抑制劑(阿尼芬凈、剛果紅和熒光素白)和細(xì)胞膜抑制劑兩性霉素B均表現(xiàn)敏感性增強(qiáng)，提示鹿藥可能對細(xì)胞壁有影響.

圖5 鹿藥正丁醇部位作用后的真菌對各種藥物刺激的敏感性

2.8 鹿藥正丁醇部位對真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的影響

從圖6可知，空白組表現(xiàn)較弱的鈣熒光白(Calcofluorwhite，CFW)熒光，陽性對照組(阿尼芬凈)細(xì)胞壁表現(xiàn)較強(qiáng)的CFW熒光，而鹿藥的正丁醇部位作用后的真菌也表現(xiàn)類似的較強(qiáng)的CFW熒光，并且真菌細(xì)胞也發(fā)生陽性組類似的聚集.文獻(xiàn)報(bào)道阿尼芬凈作用真菌后，會(huì)通過影響細(xì)胞壁葡聚糖的合成而引起細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量代償性增加[13].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：鹿藥的正丁醇部位可能對真菌的細(xì)胞壁有影響，直接或間接引起細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量的增加.

圖6 鹿藥正丁醇部位對真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的影響

3 結(jié)論

近年來，由于艾滋病、器官移植、惡性腫瘤患者等人數(shù)的增加，以及生物醫(yī)學(xué)材料如靜脈插管、心臟支架、氣管插管、導(dǎo)尿管等越來越多的應(yīng)用于人體，國內(nèi)外研究報(bào)道，真菌感染尤其是侵襲性真菌感染的發(fā)生率和死亡率呈逐漸上升趨勢[14,15].國內(nèi)外臨床統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)醫(yī)院深部真菌感染是由念珠菌引起的，其中白念珠菌構(gòu)成比最高，其次為光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌和克柔念珠菌.目前臨床上可供選擇的抗深部真菌感染藥物種類有限，耐藥菌株的產(chǎn)生，生物被膜的形成，以及藥物本身存在的毒性，深部真菌感染治療是臨床上的一大難題.

本文研究了鹿藥不同極性溶劑的萃取部位對真菌的作用，發(fā)現(xiàn)鹿藥的正丁醇部位為抗真菌有效部位，其體外表現(xiàn)較好的廣譜抗真菌甚至殺真菌活性，這與本課題組前期報(bào)道的鹿藥乙醇粗提物的抗真菌活性類似.為了評價(jià)鹿藥正丁醇部位的細(xì)胞毒性，本文通過CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鹿藥正丁醇部位的抗真菌活性濃度明顯低于其對正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性的濃度.生物被膜的形成是臨床抗真菌感染藥物耐藥性產(chǎn)生的重要原因之一.本文研究還發(fā)現(xiàn)，鹿藥的正丁醇部位對白念珠菌生物被膜的形成表現(xiàn)較優(yōu)的抑制活性，在較高濃度(1 665μg/mL)時(shí)，對成熟被膜還表現(xiàn)明顯的損傷作用(P<0.01).為了解決臨床抗真菌藥物治療可選擇方案有限的問題，藥物聯(lián)用是近年來研究報(bào)道的熱點(diǎn)策略之一[16].本課題組前期已報(bào)道鹿藥粗提物與氟康唑聯(lián)用對新生隱球菌和克柔念珠菌表現(xiàn)協(xié)同作用[9].本文研究發(fā)現(xiàn)，鹿藥正丁醇部位還能與現(xiàn)有的抗真菌藥物(兩性霉素B和阿尼芬凈)聯(lián)用表現(xiàn)較好的協(xié)同作用.初步的抗真菌作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，鹿藥正丁醇部位對真菌的細(xì)胞壁可能有損傷作用，直接或間接引起細(xì)胞壁多糖成分——幾丁質(zhì)含量增加，這與前期報(bào)道鹿藥粗提物損傷細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果相符[9].

綜上所述，鹿藥具有較好的抗真菌和抗生物被膜活性，正丁醇萃取部位為其抗真菌有效部位，本文為鹿藥有效活性成分的研究及臨床應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ).