馬鈴薯提取物聯(lián)合放療通過(guò)增加凋亡抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的研究

寶瑩娜 楊梅健 張繼紅 林宇 郁志龍 趙建國(guó)

研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯提取物中含有豐富的抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化成分，能夠抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，具有重要作用［1-3］。本研究通過(guò)采用內(nèi)蒙古本地馬鈴薯提取物聯(lián)合放療，以人結(jié)直腸癌細(xì)胞株為研究對(duì)象，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究，探討馬鈴薯提取物聯(lián)合放療對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株的作用及機(jī)制。

材料與方法

一、材料

細(xì)胞系與主要試劑：人直腸癌LS-174T細(xì)胞株，購(gòu)買于北納生物公司；馬鈴薯提取物由內(nèi)蒙古蒙健生物科技有限公司提供；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)于Gibco公司；胎牛血清購(gòu)于Hyclon公司。CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay購(gòu)于Promega公司。兔抗人GAPDH多克隆抗體購(gòu)于杰美基因公司；兔抗人Caspase-3單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體購(gòu)于Cell Signaling公司。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于BD公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：人直腸癌LS-174T細(xì)胞保持在高糖型DMEM完全培養(yǎng)基（含雙抗）中培養(yǎng)，并輔以用含10%的胎牛血清，將培養(yǎng)瓶放置于37℃、5%恒定濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況予以換液、傳代或者凍存。

2.細(xì)胞照射：所有的照射均在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院放療科加速器2室照射，應(yīng)用德國(guó)西門子直線加速器6MV-X線，源皮距SSD=100 cm，96孔板照射野：100 cm2，培養(yǎng)瓶照射野：25 cm2。照射野大小為每次需照射的細(xì)胞的培養(yǎng)瓶底總面積大小。

3.MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖水平：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的直腸癌LS-174T細(xì)胞消化離心后，加入1 mL DMEM完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，用countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算出細(xì)胞數(shù)，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，取出適當(dāng)細(xì)胞懸液加入適當(dāng)體積DMEM進(jìn)行稀釋后接種于96孔板中，置于37℃、5%恒定濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁后分別加入0 μL/孔、5 μL/孔、25 μL/孔、50 μL/孔濃度的馬鈴薯提取物，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%恒定濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h使馬鈴薯提取物和人直腸癌LS-174T細(xì)胞充分作用。4 h后將96孔板在直線加速器下照射，不同濃度分別接受0 Gy/孔、2 Gy/孔、4 Gy/孔、8 Gy/孔劑量的射線照射，接受照射后將96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后每孔加入20 μL MTS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后上機(jī)，酶免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值。按公式計(jì)算抑瘤率：（對(duì)照組A490-實(shí)驗(yàn)組A490）/對(duì)照組A490×100%。

4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將試劑盒內(nèi)10×Binding Buffer稀釋成1×Binding Buffer，用預(yù)冷的PBS將細(xì)胞清洗2遍，重懸后按照1×106個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞濃度于每組細(xì)胞中加入適量1×Binding Buffer工作液，每組吸出100 μL上述溶液（含1×105個(gè)細(xì)胞）到5 mL的培養(yǎng)管中，每組細(xì)胞加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI染液，輕柔吹打細(xì)胞，室溫（25℃）避光孵育15 min，加入400 μL×Binding Buffer到每個(gè)培養(yǎng)管中，1小時(shí)內(nèi)上機(jī)讀取結(jié)果。

5.Western blotting檢測(cè)蛋白：將細(xì)胞分為ABCD四組，分別為：A組：8 Gy照射＋1 mL馬鈴薯提取物；B組：8 Gy照射；C組：1 mL馬鈴薯提取物；D組：未接受任何處理。四組樣品均在接受相應(yīng)處理72 h后用配制的蛋白裂解液提取蛋白，上樣，跑膠，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，內(nèi)參、Bcl-2及Caspase-3加入一抗稀釋液，4℃搖床過(guò)夜，洗膜（TBST清洗3次，10 min/次），二抗孵育，室溫，避光，搖床1 h，洗膜（TBST清洗2次，TBS清洗1次，10 min/次），上機(jī)掃描，使用ODYSSEY CLX近紅外激光成像系統(tǒng)讀取結(jié)果。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料兩組數(shù)據(jù)比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、馬鈴薯提取物聯(lián)合放療能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖水平

馬鈴薯提取物單獨(dú)作用結(jié)直腸癌細(xì)胞株時(shí)，隨著提取物濃度在25 μL/mL后，對(duì)于細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增加，特別是在濃度為50 μL/mL作用72小時(shí)后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用最顯著（t=28.6，P=0.001）（見(jiàn)圖1）。馬鈴薯提取物聯(lián)合放療共同作用于LS-174T細(xì)胞，使其增殖水平受到更大抑制，在給予相同劑量的放療作用時(shí)，當(dāng)馬鈴薯提取物的濃度在25 μL/mL和50 μL/mL時(shí)對(duì)于增殖水平的抑制更加明顯。當(dāng)放療劑量在8 Gy，同時(shí)馬鈴薯提取物濃度在50 μL/mL作用LS-174T細(xì)胞72 h后，對(duì)于結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的抑制水平達(dá)到最高（t=12.1，P=0.007，P＜0.05）（見(jiàn)圖2～4）。

圖1 馬鈴薯提取物單獨(dú)作用對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響（注：當(dāng)馬鈴薯提取物濃度達(dá)到25 μL/mL后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖抑制，特別是馬鈴薯提取物濃度在50 μL/mL作用72小時(shí)抑制最明顯，與對(duì)照組比較，*t=28.6，P=0.001）

圖2 馬鈴薯提取物聯(lián)合2 Gy放療對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖水平的影響（注：馬鈴薯提取物50 μL/mL聯(lián)合2 Gy放療作用于LS-174T細(xì)胞，在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，分別與對(duì)照組相比，均對(duì)細(xì)胞增殖抑制，*t=7.0，P=0.02，**t=68.0，P=0.00，***t=39.4，P=0.001）

圖3 馬鈴薯提取物聯(lián)合4 Gy放療對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖水平的影響（注：馬鈴薯提取物50 μL/mL聯(lián)合4 Gy放療作用于LS-174T細(xì)胞，在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，分別與對(duì)照組相比，均對(duì)細(xì)胞增殖抑制，*t=5.24，P=0.04，**t=17.5，P=0.003，***t=54.4，P=0.00）

圖4 馬鈴薯提取物聯(lián)合8 Gy放療對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖水平的影響（馬鈴薯提取物50 μL/mL聯(lián)合8 Gy放療作用于LS-174T細(xì)胞，在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，分別與對(duì)照組相比，均對(duì)細(xì)胞增殖抑制，*t=9.39，P=0.01，**t=5.31，P=0.03，***t=12.1，P=0.007）

二、馬鈴薯提取物聯(lián)合放療誘導(dǎo)凋亡發(fā)生

通過(guò)對(duì)馬鈴薯提取物濃度為50 μL/mL聯(lián)合8 Gy放療作用的LS-174T細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其凋亡水平顯著高于對(duì)照組（t=18.3，P=0.003）（見(jiàn)表1）。進(jìn)一步檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，證實(shí)在該組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中，Bcl-2表達(dá)水平受到抑制，而Caspase 3表達(dá)水平升高（見(jiàn)表2）。

表1 馬鈴薯提取物聯(lián)合放療對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡水平的影響（±s）

表1 馬鈴薯提取物聯(lián)合放療對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡水平的影響（±s）

注：馬鈴薯提取物50 μL/mL聯(lián)合放療8 Gy與對(duì)照組相比較，凋亡比例顯著升高，*t=18.3，P=0.003

凋亡比例74.74±8.12*23.8±5.23 2.11±0.16 1.92±0.24組別馬鈴薯提取物50 μL/mL聯(lián)合放療8 Gy放療8 Gy馬鈴薯提取物50 μL/mL對(duì)照組

表2 馬鈴薯提取物聯(lián)合放療在蛋白水平對(duì)結(jié)直腸癌凋亡的影響（±s）

表2 馬鈴薯提取物聯(lián)合放療在蛋白水平對(duì)結(jié)直腸癌凋亡的影響（±s）

注：Werstern blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，馬鈴薯提取物聯(lián)合放療組Bcl-2表達(dá)顯著降低，Caspase 3表達(dá)顯著升高，*t=40.4，P=0.000，**t=10.1，P=0.001

0.0021±0.0001 0.0026±0.0002 0.002±0.0003組別馬鈴薯提取物50 μL/mL聯(lián)合放療8 Gy放療8 Gy馬鈴薯提取物50 μL/mL對(duì)照組蛋白質(zhì)含量Bcl-2 0.0038±0.0001*Caspase-3 0.0079±0.0004**0.0047±0.0002 0.0065±0.0001 0.0071±0.0001

討 論

馬鈴薯（solanum tuberosum）在世界各國(guó)普遍食用，經(jīng)證實(shí)其含有大量?jī)?yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、碳水化合物和礦物質(zhì)，尤其是多種有益于人體健康的小分子化合物［4］。越來(lái)越多的研究表明，馬鈴薯中的化合物在抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥等方面發(fā)揮著重要作用［5］。在前列腺癌研究中，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯提取物中的酚酸和花青素能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且通過(guò)誘導(dǎo)MAPK和JNK通路實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖的抑制作用［6］。在宮頸癌研究，對(duì)于Hela細(xì)胞馬鈴薯生物成分能夠誘導(dǎo)S期細(xì)胞周期停滯，導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制［1］。肺癌研究中，馬鈴薯提取物α-茄堿，是一種在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)的配糖生物堿，對(duì)人肺癌細(xì)胞系具有細(xì)胞毒作用［7］。以上研究都證實(shí)了馬鈴薯提取物具有癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。放療是結(jié)直腸癌的主要治療方式之一，盡管目前結(jié)直腸癌的治療效果相對(duì)較好，但是局部復(fù)發(fā)和放射抗性仍是需要探索的挑戰(zhàn)。因此，本研究通過(guò)放療聯(lián)合馬鈴薯提取物兩者結(jié)合作用結(jié)直腸癌細(xì)胞，為未來(lái)結(jié)直腸癌放療增敏劑的研究提供實(shí)驗(yàn)資料。

在本研究中，研究了不同濃度馬鈴薯提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的抑制能力。研究表明，在馬鈴薯提取物濃度為25 μL/mL和50 μL/mL時(shí)細(xì)胞的增殖抑制顯著。當(dāng)采用50 μL/mL馬鈴薯提取物作用72小時(shí)后明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。前列腺癌的研究中表明，隨著濃度增加，馬鈴薯提取物對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)［8］。

盡管在多種研究中證實(shí)，馬鈴薯提取物能夠誘導(dǎo)不同癌細(xì)胞的凋亡，但是這些研究都未與放療聯(lián)合。本研究表明，當(dāng)馬鈴薯提取物濃度大于5μL/mL并與放療結(jié)合會(huì)降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)水平。在相同劑量的放療作用下，給予50 μL/mL的馬鈴薯提取物分別在作用24 h、48 h和72 h表現(xiàn)出最高的生長(zhǎng)抑制作用。另一方面，結(jié)直腸癌細(xì)胞在8 Gy放療聯(lián)合馬鈴薯提取物50 μL/mL濃度中生長(zhǎng)72小時(shí)，其增殖顯著降低，這表明馬鈴薯提取物聯(lián)合放療對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用。

為了進(jìn)一步闡明機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯提取物聯(lián)合放療能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖，與馬鈴薯在其他癌細(xì)胞系中的促凋亡作用一致［8-9］。同時(shí)研究表明，放療聯(lián)合馬鈴薯提取物能夠使結(jié)直腸癌細(xì)胞中Caspase 3的激活和Bcl-2的失活。盡管如此，對(duì)于兩者聯(lián)合作用之后的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究已經(jīng)明確馬鈴薯提取物聯(lián)合放療能夠顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，并與細(xì)胞凋亡的激活有關(guān)。本研究提供了一種新的研究方向，未來(lái)可以通過(guò)馬鈴薯提取物來(lái)增強(qiáng)對(duì)結(jié)直腸癌的放射治療活性。