去勢對公犬血清抗氧化指標(biāo)的影響

姜西迪，阮崇美，劉 燦，徐艷麗，蒲 越，熊永潔，李 靜

（安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100）

目前飼養(yǎng)寵物犬已成為人們排解精神壓力和孤獨(dú)的一種方式，由于多數(shù)人沒有科學(xué)飼養(yǎng)意識(shí)，導(dǎo)致過剩犬只越來越多， 間接造成流浪犬?dāng)?shù)量的增加，不僅給飼養(yǎng)寵物的家庭增添壓力，也給城市管理帶來諸多麻煩。因此，許多主人開始傾向于給寵物犬絕育。其原因有三：一是從根源上控制寵物數(shù)量， 減少流浪動(dòng)物數(shù)量； 二是使寵物變得更溫順， 減少攻擊性； 三是降低生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)病率，例如乳腺腫瘤、子宮卵巢疾病、睪丸炎、前列腺疾病等［1-2］。 然而，一些爭議隨之出現(xiàn)。 以公犬為例，研究表明［3］，公犬去勢術(shù)是將公犬的性腺摘除，使其失去性行為和繁殖能力的一種外科手術(shù)。經(jīng)過去勢手術(shù)的公犬機(jī)體內(nèi)的雄性激素含量會(huì)下降。由于雄性激素會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生興奮性，雄性激素含量低導(dǎo)致公犬興奮性不足，機(jī)體耗能減少，未消耗的能量轉(zhuǎn)化為脂肪，會(huì)導(dǎo)致肥胖。 此外，生物機(jī)體在代謝時(shí)， 會(huì)產(chǎn)生一些對機(jī)體造成損害的有害物質(zhì)，這些有害物質(zhì)稱為自由基。 有研究表明［4］，營養(yǎng)過剩和脂肪攝入過量可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)自由基增加。 血清中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 和谷胱甘肽過氧化 物 酶（glutathione peroxidase，GSH-Px） 活力可以間接反映機(jī)體清除自由基的能力。 作為脂質(zhì)過氧化過程的終產(chǎn)物之一的丙二醛（malondialdehyde，MDA）可作為衡量機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)［5］。 除以上3 種物質(zhì)外， 過氧化氫 （hydrogen peroxide，H2O2） 的含量也可以用來反映機(jī)體細(xì)胞受到損害的程度。 Zhai 等［6］認(rèn)為H2O2可通過引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用。因此，該試驗(yàn)通過以公犬為試驗(yàn)對象研究其去勢前后血清抗氧化指標(biāo)的變化，探討去勢對公犬抗氧化能力的影響，為研究去勢對機(jī)體代謝的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)動(dòng)物：12 只1 歲左右健康雄性中華田園犬，體重3.5～4.0 kg，由安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并統(tǒng)一飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的動(dòng)物房。試驗(yàn)期間犬舍保持良好通風(fēng)，試驗(yàn)地點(diǎn)為外科手術(shù)實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間與飼糧營養(yǎng)水平

試驗(yàn)周期22 d，前5 d 為預(yù)飼期，后17 d 為試驗(yàn)期，自由飲水。 飼喂幼犬專用犬糧（河南鄭州市某寵物用品有限公司生產(chǎn)），飼糧主要成分及營養(yǎng)指標(biāo)見表1。

表1 幼犬專用犬糧主要成分及營養(yǎng)指標(biāo)單位：%

1.3 試驗(yàn)材料

1.3.1 試驗(yàn)材料無菌注射器，靜脈釆血針，真空貯血管， 醫(yī)用靜脈留置針， 輸液器和微量離心管（均為一次性使用），自粘繃帶，無菌棉球，乳膠管（止血帶），手術(shù)器械包，體溫計(jì)，聽診器，橡膠手套，不同規(guī)格的移液槍和移液管、玻璃瓶和錐形瓶（用于儲(chǔ)存試劑）。

1.3.2 藥液試劑75%酒精， 碘伏，0.9%生理鹽水，伊維菌素，硫酸阿托品注射液，安絡(luò)血注射液，速眠新Ⅱ注射液，蘇醒靈，注射用青霉素鈉，冰醋酸（分析純，乙酸濃度≥99.5），95%無水乙醇，蒸餾水，H2O2測試盒（批號(hào)：20200507）、SOD 試劑盒（批號(hào)：20200328）、GSH-Px 試劑盒（批號(hào)：20200509）和MDA 試劑盒（批號(hào)：20200417）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3.3 儀器設(shè)備電冰箱，恒溫水浴箱（HH-3A），小型高速離心機(jī)（Eppendorf 5424，進(jìn)口），酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan Go，芬蘭Thermofisher）等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)動(dòng)物的分組和手術(shù)將12 只雄性中華田園犬隨機(jī)分成對照組和去勢組， 每組6 只犬并做好編號(hào)。 試驗(yàn)前對所有試驗(yàn)犬肌注0.1 mL/kg伊維菌素進(jìn)行驅(qū)蟲。 預(yù)飼5 d 后，對兩組犬分別進(jìn)行術(shù)前稱重和采血， 采血完畢后對去勢組的犬進(jìn)行去勢手術(shù)，對照組的犬正常飼喂。手術(shù)恢復(fù)后第5、10、15 天分別對兩組犬進(jìn)行采血。 手術(shù)前對去勢組犬做全身基礎(chǔ)檢查， 看其各項(xiàng)生理指標(biāo)是否正常，然后開始進(jìn)行去勢手術(shù)。 手術(shù)步驟：術(shù)前30 min 注射0.04 mg/kg 的阿托品，采取仰臥保定，肌注0.15 mL/kg 速眠新Ⅱ注射液進(jìn)行全身麻醉，用保定繩將犬的四肢捆綁在手術(shù)臺(tái)上并將犬嘴拴緊， 助手用海綿鉗在犬舌頭上包一圈浸泡過生理鹽水的無菌紗布。將陰囊部位完全暴露，術(shù)者結(jié)合情況確定術(shù)部后， 對陰囊部進(jìn)行剪毛、 清洗和消毒。用兩手指將兩側(cè)睪丸擠到陰囊底部，切開皮膚和皮下組織，鈍性分離直到顯露鞘膜，切開鞘膜使睪丸從鞘膜切口內(nèi)露出， 顯露并用三鉗法結(jié)扎精索，最后術(shù)部消毒縫合即可。 術(shù)后護(hù)理：肌注青霉素進(jìn)行抗菌消炎，保持傷口清潔干燥，每天檢查傷口變化并消毒， 給犬佩戴伊麗莎白項(xiàng)圈以防犬舔咬術(shù)部而出血和感染。加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保持安靜休息，7 d 后術(shù)犬基本痊愈。

1.4.2 血清的制備和保存采血前禁食12 h，不禁水，保持犬只安靜，采血方法以頸靜脈采血為主， 個(gè)別犬可在后肢外側(cè)小隱靜脈和前肢內(nèi)側(cè)頭靜脈采血，每只犬各采血5 mL 收集在一次性真空貯血管（無抗凝劑）中。 將采集好的血液放入4 ℃的冰箱冷藏靜置2 h， 再用離心機(jī)進(jìn)行離心（3 500 r/min，10 min），用移液器將獲取的上層血清分裝并標(biāo)記于1.5 mL 微量離心管內(nèi)， 置-20 ℃冰箱冷凍保存，以便下步試驗(yàn)使用。

1.4.3 血清抗氧化指標(biāo)的測定試驗(yàn)時(shí)用羥胺法檢測SOD 活性， 用硫代巴比妥酸（TBA） 法檢測MDA 含量，用比色法檢測GSH-Px 活性和H2O2含量，最后均用酶標(biāo)儀測吸光度OD 值，具體操作過程則需要參照試劑盒的說明書。

1.4.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)，P＞0.05 則表明差異不顯著，兩組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05 表明兩組結(jié)果差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果分析

表2 顯示，去勢組和對照組第5 天、第10 天的SOD 活性均比第0 天有所降低， 第15 天的SOD 活性相對高于其他時(shí)間段。 去勢組的SOD 活性與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

表2 去勢對公犬血清超氧化物歧化酶活性的影響 單位：U/mL

表3 顯示， 去勢組的GSH-Px 活性在絕育后第5、10、15 天均低于對照組且呈顯著差異 （P＜0.05）。

表3 去勢對公犬血清谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響 單位：U/mL

表4 顯示， 去勢組的MDA 含量存在上升趨勢，但上升幅度隨時(shí)間逐漸減緩。從絕育后第5 天起，去勢組的MDA 含量開始高于對照組，且絕育后第10 天和第15 天的MDA 含量與對照組呈極顯著差異（P＜0.01）。

表4 去勢對公犬血清丙二醛含量的影響 單位：nmol/mL

表5 顯示， 對照組的H2O2含量呈下降趨勢，第10 天和第15 天呈現(xiàn)大幅度下降。 去勢組的H2O2含量開始呈下降趨勢，第5 天后H2O2含量呈上升趨勢。 去勢組的H2O2含量去勢前和第5 天均低于對照組， 第10 天和第15 天均高于對照組且差異極顯著（P＜0.01）。

表5 去勢對公犬的血清H2O2 含量的影響 單位：mmol/L

3 討論

通過研究發(fā)現(xiàn)，公犬的性行為機(jī)制比較復(fù)雜，其基礎(chǔ)表現(xiàn)為睪酮轉(zhuǎn)化為雌激素和雙氫睪酮［7］。出現(xiàn)性行為的具體表現(xiàn)有做尿標(biāo)記頻率增加、情緒反常、喜歡外出尋找母犬甚至出現(xiàn)爬胯行為。因此公犬去勢術(shù)是一種直接有效改善公犬性行為的方法，特別是針對還未性成熟的幼犬。 另一方面，去勢術(shù)也可以減少一些雄性生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生，例如前列腺疾病、睪丸炎、肛周腺瘤和會(huì)陰疝等。 目前人們關(guān)于絕育對犬只是否有弊端這一問題仍存在爭議。 除了已知研究證實(shí)絕育會(huì)導(dǎo)致犬肥胖癥和心血管疾病的增加， 研究其他方面可能存在影響的報(bào)道相對較少。國外研究人員以40 名絕經(jīng)后婦女為研究對象觀察激素替代療法前后體內(nèi)活性氧的變化， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌激素能有效抑制活性氧的產(chǎn)生［8］。陸江等［9］通過研究母犬絕育前后血清抗氧化指標(biāo)的變化， 結(jié)果顯示雌激素與抗氧化能力呈正相關(guān)， 且絕育會(huì)使母犬的抗氧化能力減弱。 但目前還未有文獻(xiàn)清楚說明公犬去勢對抗氧化能力有無影響， 基于抗氧化物質(zhì)對機(jī)體健康有重要研究意義， 該試驗(yàn)就公犬去勢對抗氧化的影響進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

抗氧化又稱抗氧化自由基， 是指能有效抑制自由基的所有低濃度物質(zhì)， 如超氧化物歧化酶SOD、 谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px 和過氧化氫酶（catalase，CAT）。它們一起構(gòu)成生物體內(nèi)的活性氧防御系統(tǒng)： 機(jī)體活性氧O2-·的第一道防線是SOD。 SOD 屬于金屬酶類，是一種重要的抗氧化物酶， 它可以將O2-·轉(zhuǎn)化為H2O2和其他氫過氧化物，將活性高的自由基轉(zhuǎn)化為活性較低的自由基，從而減輕生物氧化產(chǎn)生的有害物質(zhì)對機(jī)體帶來的損害，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，有效平衡機(jī)體的氧化與抗氧化［10］。 機(jī)體活性氧O2-·的第二道防線是CAT和GSH-Px。 CAT 的主要功能是催化H2O2分解為H2O 和O2，起到清除H2O2的作用。 因?yàn)镠2O2常被誘發(fā)均裂產(chǎn)生羥自由基（-OH）［11］，-OH 極易使多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）發(fā)生氧化， 且細(xì)胞膜的重要成分磷脂富含PUFA。Rubin 等［12］認(rèn)為H2O2對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的途徑之一就是引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化。 由于脂類過氧化是細(xì)胞老化的原因之一， 預(yù)防脂類過氧化可延緩細(xì)胞老化，而GSH-Px 可同時(shí)清除H2O2和脂類過氧化物，從而有效保護(hù)機(jī)體［13］，所以GSH-Px 可以有效減緩機(jī)體的衰老速度［14］，是重要的機(jī)體抗氧化指標(biāo)之一。

機(jī)體產(chǎn)生的氧化自由基在攻擊生物膜中PUFA 的過程中，會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，形成一種脂質(zhì)過氧化物MDA。 MDA 可使細(xì)胞膜通透性增加，結(jié)構(gòu)、功能和代謝發(fā)生改變，并同時(shí)作用于脫氧核糖核酸（DNA）、膜蛋白和酶等發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，對細(xì)胞具有嚴(yán)重的損害作用［15］。通過檢測MDA 含量可以間接反映機(jī)體抗氧化的潛在能力。

該試驗(yàn)中，對照組和去勢組的SOD 活性無顯著差異， 去勢會(huì)導(dǎo)致GSH-Px 活性降低，MDA 和H2O2含量升高， 說明去勢手術(shù)在一定程度上影響機(jī)體的抗氧化能力， 可在其術(shù)后給予提高抗氧化能力的保健藥品。 由于對照組的H2O2在第10 天與第15 天呈現(xiàn)大幅度下降， 使去勢組的H2O2出現(xiàn)階段性升高，可能與對照組犬的健康狀況有關(guān)，建議增加試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，深入研究。

4 結(jié)論

去勢對公犬血清SOD 活性無明顯影響，但會(huì)導(dǎo)致GSH-Px 活性降低，MDA 和H2O2含量升高，減弱機(jī)體抗氧化能力。