豬傳染性胃腸炎病毒疫苗株S 基因的克隆及其與流行株的比對分析

侯宏艷，潘孝成，尹 磊，張丹俊，趙瑞宏，胡曉苗，周學(xué)利

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 安徽省畜禽疫病研究中心 畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點實驗室， 安徽 合肥230031）

豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV） 可引起各種年齡豬病毒性腸炎，感染后引起豬嘔吐、嚴重腹瀉和脫水，仔豬1～28 d 是該病最易感日齡，每年的1—2 月是該病高發(fā)期［1-4］。 TGEV 除了與引起豬腹瀉的豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PoRV）、 豬 流 行 性 腹 瀉 病 毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV） 等混合感染，還能與豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRSV）、豬圓環(huán)病毒 （porcine circovirus，PCV）、 豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）等混合感染［5-8］，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大危害。

近年來， 我國多個地區(qū)對TGEV 進行了流行病學(xué)調(diào)查，報道的TGEV 檢測率存在差異。孫秋艷等［6］對2014—2016 年山東省部分地區(qū)TGE 流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，TGEV 檢測率為9.3%；徐麗華等［7］對2011—2017 年浙江省豬病毒性腹瀉的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，TGEV 的陽性率為3.05%； 杜雅楠等［8］對內(nèi)蒙古地區(qū)采集的病料進行了TGEV 檢測，顯示陽性率為11.76%，赤峰市TGEV 陽性率為20.83%；祖立闖等［9］在2007—2016 年的39 篇流行病學(xué)監(jiān)測文獻中發(fā)現(xiàn)TGEV 整體陽性感染率在0～31.86%， 還發(fā)現(xiàn)外觀健康豬群仍可檢測出TGEV 病原或抗體，健康豬群中普遍存在TGEV 隱性感染。 因此，對豬場進行TGEV 檢測很有必要。

TGEV 為RNA 病毒， 存在遺傳變異的可能。在TGEV 基因組中，S 基因編碼的氨基酸是中和抗體的主要靶點［4-5，10］。因此，該研究選擇了國內(nèi)常用的3 個廠家的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗進行TGEV RNA 提取和S 基因序列的擴增， 并與已公布流行毒株基因序列進行比對， 建立檢測豬傳染性胃腸炎病毒的RT-PCR 診斷方法， 初步判斷豬傳染性胃腸炎病毒疫苗與流行菌株S 基因的遺傳性，為臨床疫苗的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 疫苗

購買國內(nèi)目前廣泛使用的豬傳染性胃腸炎的3 個廠家的凍干疫苗，分別記作疫苗A、疫苗B 和疫苗C。

1.2 主要試劑

病毒檢測用RNA 提取試劑盒（離心柱型）和Fastking cDNA 第一鏈合成試劑盒購自TaKaRa 公司；2×Taq mix、DNA 凝膠回收試劑盒和DL 2 500 Marker 等均購自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖購自美國Sigma 公司。

1.3 RNA 提取

將疫苗A、疫苗B、疫苗C 按1 頭份加入1 mL DEPC 水進行溶解，-80 ℃反復(fù)凍融3 次后，取200 μL 按病毒檢測用RNA 提取試劑盒說明書提供的方法提取疫苗中的TGEV RNA，-80 ℃保存。

1.4 cDNA 鏈合成

將“1.3”項下保存的疫苗A、疫苗B、疫苗C 的RNA 取出溶解， 按FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書的方法進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

1.5 RT-PCR 檢測

引物參照樊雅婷等［11］報道的，參照GenBank上TGEV 毒株的S 基因cDNA 序列設(shè)計1 對引物， 上游引物序列為5′-CCACTTCGTTAACACACC-3′；下游引物序列為5′-GATAGCCCCAACTATGGTA-3′。 該引物預(yù)期擴增片段大小為2 279 bp，為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。對“1.4”項下提取的cDNA 進行PCR 擴增，反應(yīng)體系為：上、下游引物各1 μL（20 μmol/L）、cDNA 模板2 μL、2×Taq mix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL， 總體系25 μL。 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。 得到的RTPCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 目的基因克隆與測序

參照DNA 凝膠回收試劑盒說明書進行目的基因凝膠回收與純化， 純化的目的基因片段送至通用生物（安徽）有限公司測序。

1.7 序列分析

將疫苗A、 疫苗B、 疫苗C 的S 基因序列在NCBI 網(wǎng)站的Blast 上與近年公開發(fā)表的來自不同地區(qū)的基因序列進行遺傳分析， 得到與已知序列的同源性。 再選取登錄號為AF104420.1-Britain、AY587882.1 -Nanjing、DQ811786.2 -America、EU074218.2 -Harbin、FJ755618.2 -Harbin、JQ700304 -fuzhou、KC609371.1 -Shanghai、KX900411.1 -United States、M94099.1 -Spain 和MK272773.1-Fushun 的S 基因序列，與疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因序列一起，用MegAlign 軟件進行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因RT-PCR 檢測結(jié)果

對疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因片段進行RT-PCR 擴增， 均得到預(yù)期大小約為2 279 bp 的DNA 片段（見圖1），并將純化后的產(chǎn)物送至通用生物（安徽）有限公司測序。

圖1 TGEV 疫苗A、疫苗B、疫苗C的S 基因RT-PCR 擴增結(jié)果

2.2 序列分析

將疫苗A、 疫苗B、 疫苗C 的S 基因序列在NCBI 網(wǎng)站的Blast 上進行序列比對， 利用MegAlign 軟件進行核苷酸同源性比對分析（見圖2），并繪制S 基因克隆序列的系統(tǒng)發(fā)生樹 （見圖3）。結(jié)果表明，疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因序列兩兩間的同源性在96.7%以上；疫苗A 與NCBI 已知序列的同源性在94.43%～99.82%， 疫苗B 與NCBI 已知序列的同源性在95.30%～99.64%，疫苗C 與NCBI 已知序列的同源性在93.48%～98.38%。

圖2 TGEV 疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因核苷酸同源性比對分析結(jié)果

圖3 TGEV 疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因克隆序列的系統(tǒng)發(fā)生樹

選取10 個來自國內(nèi)外的S 基因序列，與疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因序列一起，用MegAlign軟件進行比對分析。從系統(tǒng)發(fā)生樹可以看出，疫苗A 和疫苗C 在一個分支上， 且與國外M94099.1-Spain 株在同一分支上， 而疫苗B 在另一個分支上，與國內(nèi)JQ700304-fuzhou 株在同一分支上。

3 討論與結(jié)論

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）是一種包膜病毒，屬于冠狀病毒科（coronaviridae，CoV），該病毒有一個28.5 kbp 的單鏈陽性RNA 基因組，S 蛋白位于病毒表面， 主要形成病毒纖突。 在功能上，TGEV 的S 糖蛋白是中和抗體的主要靶點，還與宿主細胞的嗜性有關(guān)， 能夠與宿主細胞受體相互作用， 讓病毒侵入細胞；S 蛋白還決定TGEV 的血凝活性。 有學(xué)者認為TGEV 的S 基因為易變基因，對TGEV 的S 基因進行克隆和分析值得深入研究［4］。

該研究購買了市場上常用的TGEV 疫苗A、疫苗B 和疫苗C，提取疫苗中TGEV 的RNA，對S基因片段進行RT-PCR 擴增， 均得到了預(yù)期大小的基因片段。 將獲得的S 基因序列在Blast 上進行比對后發(fā)現(xiàn)，疫苗A、疫苗B、疫苗C 的S 基因序列兩兩間的同源性在96.7%以上，且3 種疫苗的S 基因與NCBI 已知序列的同源性超過96%的占比在80%以上，說明目前TGEV 流行株的S 基因變異較低，市場上所用疫苗能有效防控TGEV，與孫秋艷等［6］對山東省部分地區(qū)的TGEV 檢測的檢出率為9.3%， 檢出率相對其他常發(fā)?。≒EDV、PRRS、PCV等）要低的結(jié)論相符，與樊雅婷等［11］研究分離的T04 株S 基因變異較低且相對穩(wěn)定一致。

在對TGEV 的研究中， 朱蘊暖等［12］建立了TGEV 的間接免疫熒光（IFA）檢測方法，王賽［13］用抗TGEV 重組N 蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體建立了一種雙抗體夾心ELISA 檢測方法。 在開發(fā)有效的抗TGEV 療法中，單玲玲等［14］認為IFN-y可作為一種有效的治療制劑。 但在實際生產(chǎn)中，TGEV 仍然以疫苗預(yù)防為主， 病原檢測多采用RT-PCR 方法，如李嘉琛等［15］對內(nèi)蒙古某豬場的糞便樣品進行RT-PCR 鑒定，郭容利等［16］設(shè)計32對PCR 引物分片段擴增TGEV 江蘇分離株JS2012 全基因組并進行分析。 在該研究中建立的TGEV 的S 基因RT-PCR 方法，成功獲得了TGEV疫苗中的S 基因， 所以該方法可以用來檢測腹瀉病豬是否感染了TGEV，對監(jiān)測TGEV 的S 基因變異情況和對TGEV 的防控都有生產(chǎn)意義。