TCDCA 對(duì)IL-1β 刺激下AA 大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞中PGE2 分泌的影響

姜雪瑩，錢英紅，趙俊利，張 凱，段 艷，李培鋒，何秀玲，毛 偉，曹金山，郭文瑞

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疾病診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 內(nèi)蒙古 呼和浩特010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031 ）

動(dòng)物膽汁在臨床疾病治療中被廣泛應(yīng)用，最重要的活性成分之一是膽汁酸類化合物， 膽汁中膽汁酸類成分在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮護(hù)眼、護(hù)肝、調(diào)節(jié)腸胃功能、抗癌、抗炎、止咳、平喘、平衡血糖以及保護(hù)神經(jīng)等藥理作用［1］。 牛磺鵝去氧膽 酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）是動(dòng)物膽汁中主要有效成分之一，化學(xué)名稱為3α，7α-二羥基-5β-24-膽烷酰-N-?；撬幔声Z去氧膽酸（3α，7α-二羥基-5β-膽烷酸，CDCA）的羥基與?；撬幔?-氨基乙磺酸，Tau） 的氨基之間縮水而成的結(jié)合型膽汁酸［2-3］。 前期研究發(fā)現(xiàn)，劑量為0.1 g/（kg·BW）和0.2 g/（kg·BW） 的TCDCA 均能夠降低SO2誘發(fā)的小鼠咳嗽模型氣管和肺組織中前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的分泌［3］。 同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)TCDCA 能夠通過抑制小鼠血清和氣管組織中NO 含量，促進(jìn)氣管組織中cAMP 的產(chǎn)生，降低SO2誘發(fā)的呼吸道炎癥部位中PGE2的分泌，進(jìn)而發(fā)揮鎮(zhèn)咳、平喘等作用［4］。 Arndt 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，TCDCA能夠?qū)π∧c炎癥產(chǎn)生緩解作用， 在吲哚美辛誘導(dǎo)發(fā)生的急、慢性小腸炎癥反應(yīng)中TCDCA 還能夠顯著抑制白細(xì)胞在炎癥反應(yīng)發(fā)生部位的聚集和游走。 TCDCA 劑量為［0.1、0.2 g/（kg·BW）］時(shí)對(duì)由甲醛（5%）、角叉菜膠（1%）引發(fā)的大鼠炎性反應(yīng)中局部組織的PGE2含量均有顯著抑制作用。國(guó)外學(xué)者Nguyen 等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝臟竇狀隙上皮細(xì)胞cAMP 生成的過程中，TCDCA 具有顯著的促進(jìn)作用。 由此可知，TCDCA 對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)生具有重要的調(diào)節(jié)作用。

成纖維樣滑膜細(xì)胞 （fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）關(guān)節(jié)組織中具有重要作用的細(xì)胞。 FLS 的大量增生以及在關(guān)節(jié)滑膜部位的重新分布是發(fā)生RA 特征性病變的主要表現(xiàn)之一。國(guó)內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)， 在RA 發(fā)病過程中成纖維細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)是與非疾病相關(guān)組織的成纖維細(xì)胞的重要不同點(diǎn)。 通過體外分離培養(yǎng)FLS 的研究發(fā)現(xiàn)，RA 患者的FLS 主要發(fā)生細(xì)胞增殖速度和遷移能力明顯增強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)具有多樣性等生物學(xué)特性變化。當(dāng)分離培養(yǎng)的FLS 在多種因素的刺激下， 細(xì)胞因子（如IL-1β 等）和金屬基質(zhì)蛋白酶的分泌、表達(dá)和活性均有所提高， 促使炎癥和自身免疫反應(yīng)發(fā)生［7-9］。 Liu 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在完全弗氏佐劑（complete freund′s adjuvant，CFA）誘導(dǎo)的大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）模型中，引發(fā)的大鼠足跖腫脹（包括原發(fā)性和繼發(fā)性）均能夠由TCDCA產(chǎn)生不同程度的抑制效應(yīng)。由以上研究結(jié)果可知，TCDCA 均能在由物理性、化學(xué)性和細(xì)菌性因素引起的急、 慢性炎癥發(fā)生過程中發(fā)揮明顯的抑制作用。 為了進(jìn)一步探究在AA 模型大鼠急、慢性炎癥反應(yīng)過程中TCDCA 的作用機(jī)制，該研究以AA 模型大鼠FLS 為研究對(duì)象，采用ELISA 方法檢測(cè)了TCDCA 和IL-1β 作用下AA 大鼠FLS 上清液中PGE2的含量，分析了TCDCA 對(duì)IL-1β 刺激下AA模型大鼠FLS 中PGE2分泌情況的影響，進(jìn)一步揭示動(dòng)物機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)TCDCA 的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物該試驗(yàn)選用的Wistar 大鼠均購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心， 動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK-（軍）2007-004， 選取大鼠體重為（160±20）g。

1.1.2 試劑TCDCA 由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)藥理學(xué)課題組從雞膽汁中提取和純化，純度為98.6%；醫(yī)用卡介苗（BCG）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PGE2ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cayman 公司；IL-1β （批號(hào)：I2393）、 地塞米松（批號(hào)：50-02-2）均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3 主要儀器設(shè)備低溫高速離心機(jī) （Sigma-3-30K）；多功能酶標(biāo)儀（Synergy 4，美國(guó)Bio-Tek）；超凈工作臺(tái)（AIRTECH）；37 ℃搖床；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher）。

1.2 佐劑性大鼠關(guān)節(jié)炎模型的建立

選擇Wistar 大鼠12 只飼養(yǎng)1 周，使其熟悉環(huán)境，以減少應(yīng)激的產(chǎn)生。根據(jù)該試驗(yàn)需要隨機(jī)分為正常對(duì)照組和AA 模型組，每組6 只大鼠。 根據(jù)參考文獻(xiàn)［11］中的方法制備完全弗氏佐劑（CFA），正常對(duì)照組不予處理，AA 模型組則需左后足趾皮內(nèi)注射0.1 mL 制備好的CFA 以復(fù)制AA 大鼠模型。

1.3 模型的評(píng)價(jià)

AA 大鼠模型復(fù)制后18～21 d， 觀察各組大鼠的雙側(cè)足關(guān)節(jié)、足爪以及尾部的主要病變。

1.4 AA 大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)特征的鑒定

1.4.1 滑膜組織的采集急性處死大鼠后， 將大鼠放于75%酒精中浸泡2～3 min，根據(jù)文獻(xiàn)［11-12］中的方法采集滑膜組織，用于后期細(xì)胞分離培養(yǎng)。每只大鼠應(yīng)盡可能多收集雙側(cè)滑膜組織， 收集量為10～20 mg。

1.4.2 成纖維樣滑膜細(xì)胞的分離與培養(yǎng)采用文獻(xiàn)［12-13］中的方法，提取建立成功的AA 模型大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)和傳代，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 分組與給藥

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，將該試驗(yàn)分為4 組，即空白對(duì)照組（AA 大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞，簡(jiǎn)稱FLS，下同）；IL-1β 刺激組：FLS+ IL-1β （10 ng/μL）；TCDCA 作用組：FLS+IL-1β （10 ng/μL）＋TCDCA（10-4mol/L）；地塞米松組：FLS+IL-1β（10 ng/μL）+地塞米松（500 nmol/L）。

1.6 細(xì)胞懸液的制備

將經(jīng)組織塊貼壁法分離得到的單個(gè)滑膜細(xì)胞用含有10 ng/μL IL-1β 的DMEM 培養(yǎng)液配制成濃度為5×108cells/L 滑膜細(xì)胞懸液， 加入24 孔培養(yǎng)板， 每孔1 mL， 于37 ℃、5%CO2中作用48 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)的上清液，按照分組用無菌離心管離心，4 ℃、2 000 r/min 離心10 min 去除細(xì)胞碎片，輕輕吸取上清液，放入1.5 mL 新的無菌Eppendorf 管，封蓋、編號(hào)后保存在-70 ℃冰箱中待測(cè)。

1.7 TCDCA 對(duì)IL-1β 刺激下AA 大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞中PGE2 分泌的影響

采用ELISA 方法，按照Cayman 公司PGE2檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行PGE2含量的檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AA 大鼠的鑒定

由圖1 可知，在AA 模型組大鼠造模后18～21 d，與空白對(duì)照組（見圖1a）比較，AA 模型組大鼠在腕部及掌部出現(xiàn)紅腫， 并且腫脹明顯 （見圖1b），證明AA 大鼠模型制備完成。

圖1 空白對(duì)照組與AA 模型組大鼠腕部及掌部對(duì)比

2.2 成纖維樣滑膜細(xì)胞的光鏡觀察

由圖2a 可知，在組織周邊有細(xì)胞長(zhǎng)出，分離及培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)較為均一、 呈長(zhǎng)梭狀并伸出突起，局部仍分布少量圓形細(xì)胞。傳代后第5 天即在瓶底稠密分布，較前期生長(zhǎng)更快，形態(tài)更均一，第7 天可予以再次傳代。 傳代細(xì)胞形態(tài)見圖2b。

圖2 成纖維樣滑膜細(xì)胞光鏡觀察（100×）

2.3 PGE2 含量的檢測(cè)

采用ELISA 方法檢測(cè)AA 大鼠FLS 上清液中PGE2含量，PGE2的標(biāo)準(zhǔn)曲線 見圖3。 由圖3 和OriginLab Origin V8.0 軟件處理數(shù)據(jù)結(jié)果可知，相關(guān)系數(shù)R2=0.997。

圖3 PGE2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖4 可知，與空白對(duì)照組相比，IL-1β 刺激組、TCDCA 作用組、 地塞米松組AA 大鼠FLS 中PGE2的分泌量均顯著（P<0.05）升高；與IL-1β 組相比，TCDCA 作用組和地塞米松組均能夠顯著（P<0.05） 抑 制AA 大 鼠FLS 中PGE2的 分 泌。TCDCA 對(duì)AA 大鼠FLS PGE2的分泌呈現(xiàn)抑制作用。 TCDCA 在10-4mol/L 濃度時(shí)， 能夠顯著抑制IL-1β 刺激AA 大鼠FLS PGE2的分泌。

圖4 TCDCA 對(duì)IL-1β 刺激下AA大鼠FLS PGE2 分泌量的影響

3 討論

前列腺素（prostaglandins，PGs）是類花生酸家族的成員，可以由體內(nèi)幾乎所有的細(xì)胞產(chǎn)生。PGE2是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的脂質(zhì)， 作為前列腺素類化合物中的成員， 是二十碳飽和脂肪酸形成的花生四烯酸通過一系列酶催化反應(yīng)形成的產(chǎn)物，對(duì)免疫細(xì)胞具有明顯抑制作用。 PGE2是一種重要的脂質(zhì)介質(zhì)， 可在機(jī)體的所有類型細(xì)胞中表達(dá)，在機(jī)體炎癥和發(fā)熱的病理生理過程中，引發(fā)炎性細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)，聚集在炎性反應(yīng)部位，擴(kuò)張毛細(xì)血管使其通透性增加，促進(jìn)炎性細(xì)胞滲出，繼而引起發(fā)熱及炎癥介質(zhì)IL－1β 的含量增加， 催化爆發(fā)式炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而放大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)生炎癥和發(fā)熱的部位和組織PGE2的含量增加，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用［14-16］，研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥和免疫反應(yīng)發(fā)生的過程中，TCDCA 可通過對(duì)糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）介導(dǎo)的信號(hào)通路在基因組學(xué)水平上引發(fā)激活效應(yīng)， 進(jìn)而發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。 同時(shí)研究結(jié)果還表明，GR 受體能夠被TCDCA 激活，啟動(dòng)了基因組學(xué)和非基因組學(xué)的調(diào)控作用， 從而促進(jìn)了抗炎相關(guān)因子脂皮素-1（lipocortin-1，LC-1）的表達(dá)。目前，LC-1 已被公認(rèn)為糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GCs）參與抗炎反應(yīng)的重要調(diào)控因子［16］。 磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2） 重要的內(nèi)源性抑制劑為L(zhǎng)C-1，是介導(dǎo)GCs 發(fā)揮抗炎作用的重要因子。 在炎性介質(zhì)合成釋放過程中，PLA2 為關(guān)鍵的影響因素， 同時(shí)也是炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)的中心。 花生四烯酸的產(chǎn)生過程中，PLA2 激活后作用在膜磷脂上起促進(jìn)作用，花生四烯酸在一系列合成酶的作用下生成炎性介質(zhì)PGE2。 另一項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)， 白介素-1β （interleukin 1 beta，IL-1β） 能夠刺激FLS 進(jìn)而產(chǎn)生活化效應(yīng)［17］。 在IL-1β 刺激FLS 過程中，環(huán)加氧酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表達(dá)量升高，提高了PGE2的合成分泌水平。 TCDCA 能夠促進(jìn)FLS 細(xì)胞中GR 受體的激活， 降低血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1） 的表達(dá)量，這一抑制效應(yīng)可能與TCDCA 增強(qiáng)LC-1 的表達(dá)，降低COX-2 產(chǎn)生，以及抑制cPLA2 的表達(dá)量有關(guān)［18-19］。 COX-2 是COX 兩種同工酶中的一種， 作為COX-2 下游重要的影響合成因子mPGES-1。在PGE2合成過程中，mPGES-1 為這一合成反應(yīng)中的最后一個(gè)催化酶， 在高表達(dá)炎癥因子IL-1β、TNF-α 等的條件下其催化作用能夠被提高，從而促進(jìn)PGE2的合成，分泌量提高［20-21］。

研究結(jié)果顯示，TCDCA 能夠顯著抑制IL-1β刺激下AA 大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞中PGE2的分泌。綜上所述，TCDCA 能夠增強(qiáng)GR 介導(dǎo)的基因組學(xué)轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)，抑制AA 大鼠炎癥介質(zhì)PGE2的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用。 這一結(jié)果與TCDCA 能在動(dòng)物機(jī)體炎性組織中減少一氧化氮（NO）、PGE2以及白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）等的含量，在體內(nèi)發(fā)揮抗炎作用一致［10］。