ANXA2 siRNA對甲狀腺未分化癌細胞凋亡及放療敏感性的影響

楊慧慧，闞全娥，于 璐，劉明博

1)河南省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450003 2)河南省人民醫(yī)院放療科 鄭州 450003

甲狀腺未分化癌在全部甲狀腺癌中約占1%，其惡性程度高，發(fā)展迅速，大部分甲狀腺未分化癌并非由碘所引起[1]，而放射治療對于非碘導(dǎo)致的病灶治療效果最為顯著。膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)是膜聯(lián)蛋白家族成員之一，能夠通過調(diào)控鈣離子通道進而影響細胞的生長、凋亡過程[2]。ANXA2在肝癌、胃癌、腎透明細胞癌、食管癌組織中表達上調(diào)，參與癌細胞的生長過程[3-6]。本研究以甲狀腺未分化癌細胞8505c為對象，探討干擾ANXA2對癌細胞增殖、凋亡及放療敏感性的影響，以期為甲狀腺未分化癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料8505c細胞購自鄭州大學(xué)。ANXA2小干擾RNA(ANXA2 siRNA)、陰性對照序列(NC siRNA)為山東維真生物科技有限公司產(chǎn)品，Q6000紫外分光光度計為美國Quawell公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒、Lip2000轉(zhuǎn)染試劑為美國Thermo公司產(chǎn)品，BCA定量檢測試劑盒為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。ANXA2、p38、磷酸化p38(p-p38)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)、GAPDH多克隆抗體均為武漢金開瑞生物工程有限公司產(chǎn)品，胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品。

1.2細胞分組及轉(zhuǎn)染8505c細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，分為對照組、陰性對照組(NC組)和干擾組，其中NC組和干擾組分別轉(zhuǎn)染NC siRNA和ANXA2 siRNA，對照組不做處理。

1.3RT-PCR檢測細胞中ANXA2mRNA的表達培養(yǎng)48 h后，提取3組細胞RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA后行PCR。ANXA2上游引物序列為5’-CCCCACCTCCAGAAAGTAT-3’，下游為5’-TTCAGTCATCTCCACCACA-3’。GAPDH(內(nèi)參)上游引物序列為5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’，下游為5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGAC-3’。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性120 s；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，35個循環(huán)；72 ℃總延伸360 s。采用2-ΔΔCt法計算ANXA2 mRNA的表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.4Westernblot檢測細胞中ANXA2蛋白的表達培養(yǎng)48 h后，提取3組細胞總蛋白，BCA定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液以4∶1的比例混合，煮沸5 min，每孔上樣40 μL，100 V電壓聚丙烯酰胺凝膠電泳120 min。50 mA、4 ℃半干法轉(zhuǎn)膜60 min。最后用50 g/L脫脂奶粉溶液室溫封閉90 min。加按1∶1 000稀釋的一抗(ANXA2多克隆抗體)，4 ℃孵育過夜。再加按1∶2 000稀釋的二抗，37 ℃孵育90 min。滴加顯色液，曝光，激光成像系統(tǒng)拍照掃描，以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.5細胞增殖檢測取3組細胞，接種到96孔培養(yǎng)板，每孔加4×104個細胞，每組設(shè)6個復(fù)孔，以不加細胞的孔為空白調(diào)零孔。培養(yǎng)48 h后，常規(guī)MTT法檢測細胞增殖能力(酶標儀檢測波長為490 nm)。細胞存活率=(實驗組吸光度-空白調(diào)零孔吸光度)/(對照吸光度-空白調(diào)零孔吸光度)×100%。

1.6細胞凋亡檢測培養(yǎng)48 h后收集3組細胞，胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心10 min，采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡，計算凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.7細胞克隆實驗將3組細胞接種到6孔培養(yǎng)板，每孔1×106個，過夜培養(yǎng)。隨后用6MV-X射線室溫垂直照射，劑量為0、2、4、6、8 Gy(0.8 Gy/min)。培養(yǎng)12 d后，冷甲醇固定，姬姆薩染色30 min。觀察并計數(shù)所形成的細胞集落大于50個的菌落。存活分數(shù)為受照射細胞與對照細胞克隆形成率的比值。D0為存活曲線直線部分斜率的倒數(shù)。放射增敏比為對照組(或NC組)與干擾組D0的比值。實驗重復(fù)3次。

1.8Westernblot檢測細胞中p38、p-p38、CleavedCaspase-3蛋白的表達對照組、NC組和干擾組細胞培養(yǎng)48 h后，提取細胞中的總蛋白，同1.4方法檢測細胞中p38、p-p38、Cleaved Caspase-3蛋白的表達。以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示p38、p-p38、Cleaved Caspase-3蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較3組細胞各指標的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準 α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組細胞中ANXA2表達水平比較結(jié)果見圖1、表1。與對照組相比，NC組細胞中ANXA2水平無明顯變化，而干擾組細胞中ANXA2 mRNA和蛋白表達水平降低。

圖1 3組細胞中ANXA2蛋白的表達水平表1 3組細胞ANXA2 mRNA和蛋白表達水平的比較

組別nANXA2 mRNAANXA2蛋白對照組31.00±0.020.52±0.07NC組31.04±0.140.53±0.05干擾組30.34±0.05*0.11±0.02*F61.81366.269P<0.001<0.001

*:與其他2組相比，P<0.05

2.2 3組細胞存活率和凋亡率的比較與對照組和NC組相比，干擾組細胞存活率降低，凋亡率升高，結(jié)果見表2。

表2 3組細胞存活率和凋亡率比較 %

*:與其他2組比較，P<0.05

2.3 3組細胞放療敏感性比較見圖2。從圖2可以看出，干擾組細胞存活分數(shù)降低，放療敏感性增強，相對對照組和NC組的放射增敏比為2.013和2.078。

圖2 細胞存活曲線

2.4 3組細胞p38、p-p38、CleavedCaspase-3表達水平比較與對照組和NC組相比，干擾組細胞中凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3及p-p38水平均升高。見圖3、表3。

組別np38p-p38Cleaved Caspase-3對照組30.68±0.140.16±0.020.57±0.08NC組30.65±0.090.14±0.050.56±0.04干擾組30.69±0.160.51±0.11*0.93±0.24*F0.07325.9806.096P0.930<0.0010.036

*:與其他2組比較，P<0.05

3 討論

膜聯(lián)蛋白家族包含12個蛋白家族成員，是一種與磷脂結(jié)合蛋白有關(guān)的蛋白家族，該蛋白家族成員生物學(xué)功能不同，與細胞有絲分裂、細胞凋亡、細胞衰老等有關(guān)[7-8]。ANXA2是膜聯(lián)蛋白A家族的成員，該基因定位于15q21-q22染色體上，其在胰腺癌、乳腺癌、胃腺癌組織及肝癌細胞中表達上調(diào)，而在前列腺癌組織中表達缺失[9-13]。Trojanowicz等[14]在甲狀腺乳頭癌中發(fā)現(xiàn)ANXA2高表達。

Jimenez等[15]的研究表明，敲除結(jié)直腸癌細胞caco2的ANXA2基因后，細胞的生長能力與野生型的caco2細胞相比明顯下降，細胞凋亡率升高。孫夢瑤[16]通過siRNA干擾胃癌細胞SGC-7901中ANXA2的表達，發(fā)現(xiàn)細胞增殖能力下降，凋亡能力沒有變化。本研究結(jié)果顯示，干擾ANXA2的表達后，甲狀腺未分化癌細胞存活率降低，凋亡率升高，說明干擾ANXA2能夠抑制甲狀腺未分化癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。

p38信號通路參與癌細胞生長過程。Wang等[17]的研究表明，苦參堿能夠通過促進p38磷酸化而抑制Hela細胞增殖。癌細胞的凋亡與多種基因的調(diào)控有關(guān)，是細胞內(nèi)多種信號途徑傳導(dǎo)的最終結(jié)果。Li等[18]研究表明，甲狀腺癌中p38信號通路激活受到抑制，而激活p38信號通路能夠通過促進Cleaved Caspase-3蛋白表達誘導(dǎo)甲狀腺未分化癌細胞凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾ANXA2后，甲狀腺未分化癌細胞8505c中Cleaved Caspase-3、p-p38水平升高。提示干擾ANXA2能夠促進甲狀腺未分化癌細胞中p38信號通路激活，促進Caspase-3活化，從而抑制細胞增殖，誘導(dǎo)凋亡。

甲狀腺未分化癌是一種非碘攝取的病灶，這種病灶放射治療效果最為顯著。本研究結(jié)果顯示干擾ANXA2的表達后，8505c細胞存活分數(shù)降低，放療敏感性增加。

綜上所述，干擾ANXA2能夠抑制甲狀腺未分化癌細胞增殖，促進細胞凋亡，增強放療敏感性，其機制可能與p38信號通路有關(guān)。本研究結(jié)果為靶向ANXA2治療甲狀腺未分化癌提供了理論基礎(chǔ)。