AD患者血清核酸氧化損傷產(chǎn)物與抗氧化物質(zhì)相關(guān)性分析

李文正， 禹松林， 尹逸叢， 于佳磊， 王丹晨， 鄒雨桐， 邱 玲

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100730）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是常見的神經(jīng)退行性疾病之一，早期干預(yù)可能是延緩AD進程的重要措施[1]。氧化應(yīng)激與自由基損傷假說被認(rèn)為是AD的重要發(fā)病機制[2]。有研究結(jié)果顯示，在AD患者中，DNA和RNA的氧化損傷比蛋白質(zhì)、脂質(zhì)氧化損傷出現(xiàn)更早[3]。研究AD患者DNA和RNA氧化損傷與體內(nèi)抗氧化損傷物質(zhì)之間的關(guān)系，對AD的防治具有重要意義。8-氧化脫氧鳥苷（8-oxo-7，8-dihydro-deoxyguanosine，8-oxo-dGsn） 和8-氧化鳥苷（8-oxo-7，8-dihydroguanosin，8-oxo-Gsn）是公認(rèn)的評價DNA和RNA氧化損傷的重要標(biāo)志物。已有研究證實8-oxo-dGsn等核酸氧化損傷產(chǎn)物可作為AD早期篩查及干預(yù)的指標(biāo)[4]。維生素（vitamin，Vit）A、Vit E及微量元素硒具有抗氧化功能，可能與β-淀粉樣蛋白（amyloid beta protein，Aβ）清除及認(rèn)知功能有關(guān)[5-6]。目前，有關(guān)DNA和RNA氧化損傷與Vit A、Vit E及微量元素硒的關(guān)系尚未見相關(guān)報道。本研究擬分析AD患者核酸氧化損傷產(chǎn)物與抗氧化物質(zhì)之間的關(guān)系，以期為AD的預(yù)防及早期干預(yù)提供幫助。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年11月—2019年3月中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院明確診斷為AD的患者55例，其中男28例、女27例，年齡（74.13±1.34）歲。選取同期中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院體檢健康者64名作為正常對照組，其中男32名、女32名，年齡（68.45±1.41）歲，肝功能、腎功能和脂代謝22項指標(biāo)（鉀、鈉、氯、總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、總膽紅素、直接膽紅素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、葡萄糖、尿素、尿酸、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、無機磷、總鈣）均正常。2個組之間年齡及性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。將所有對象按年齡分為<60歲、60～69歲、70～79歲和≥80歲4個年齡段。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理 采用促凝管采集所有對象清晨空腹靜脈血3 mL，室溫靜置60 min，2 500×g4 ℃離心10 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱保存，測定時室溫復(fù)溶。本研究所用的血清樣本均為臨床檢測剩余血清。

1.2.2 8-oxo-Gsn和8-oxo-dGsn測定 使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）檢測8-oxo-Gsn和8-oxo-dGsn[7]。基本步驟：將血清樣本/標(biāo)準(zhǔn)品加入同位素內(nèi)標(biāo)溶液，與乙腈充分混勻后離心，吸取離心后的上層有機相，加入96深孔板，干燥后使用去離子水復(fù)溶，搖床震蕩混勻，上機檢測。檢測儀器為Xevo TQ-XS液質(zhì)聯(lián)用分析儀（美國Waters公司），色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm；美國Waters公司），以0.1%甲酸水溶液和甲醇分別作為流動相，梯度洗脫，流速為 0.4 mL/min，柱溫30 ℃。質(zhì)譜采用電噴霧正離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)測模式。

1.2.3 Vit A和Vit E檢測 采用LC-MS/MS檢測Vit A和Vit E水平[8]?；静襟E：將血清樣本/標(biāo)準(zhǔn)品加入內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，依次加入甲醇及ZnSO4溶液沉淀蛋白質(zhì)，然后加入正己烷，震蕩混勻后離心，取上清液，干燥后使用甲醇水溶液（V∶V=80∶20）復(fù)溶，上機檢測。檢測儀器為ACQUITY UPLC系統(tǒng)（美國Waters公司）串聯(lián)AB SCIEX 4000 QTrap 質(zhì)譜儀（美國SCIEX公司）。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH Phenyl 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm；美國Waters公司）。流動相A相為0.1%甲酸溶液、B相為甲醇。梯度洗脫，流速為 0.4 mL/min，柱溫45 ℃。質(zhì)譜采用電噴霧正離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)測模式。

1.2.4 血清硒檢測 采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）檢測血清硒?；静襟E：取200 μL完全復(fù)溶的血清樣本置于試管中，加入1 800 μL預(yù)配置的稀釋液[0.1%硝酸（60%～70%）+0.01%Triton X-100），渦旋震蕩混勻1 min，上機檢測。檢測儀器為iCAP Q電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國ThermoFisher Scientific公司）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件及Prism 8.2.1軟件進行統(tǒng)計分析。采用Kolmogorov- Smirnov檢驗判斷計量資料的正態(tài)性。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。呈非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman相關(guān)分析評估各項指標(biāo)之間的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD組與正常對照組各項指標(biāo)檢測結(jié)果比較

AD組血清硒、Vit A水平顯著低于正常對照組（P<0.01），血清8-oxo-dGsn水平顯著高于正常對照組（P<0.01）。血清Vit E及8-oxo-dGsn水平2個組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 AD組與正常對照組各項指標(biāo)檢測結(jié)果比較

2.2 AD組與正常對照組不同年齡段各項指標(biāo)的比較

AD組各年齡段血清硒水平均低于正常對照組同年齡段（P<0.01）；<60歲和60～69歲2個年齡段血清Vit A水平均低于正常對照組同年齡段（P<0.01），血清8-oxo-dGsn水平則高于正常對照組同年齡段（P<0.05）。2個組70～79歲和≥80歲2個年齡段血清Vit A、8-oxo-dGsn水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。正常對照組各年齡段血清Vit E、8-oxo-Gsn水平與AD組同年齡段比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 AD組與正常對照組不同年齡段之間各項指標(biāo)的比較

2.3 各項指標(biāo)之間的相關(guān)性

在所有人群中，血清8-oxo-dGsn、8-oxo-Gsn水平與年齡呈正相關(guān)（r值分別為0.443、0.782，P<0.01），血清硒水平與血清Vit A、Vit E水平呈正相關(guān)（r值分別為0.330、0.401，P<0.01），血清8-oxo-dGsn水平與血清8-oxo-Gsn水平呈正相關(guān)（r=0.644，P<0.01）。

在正常對照組中，血清硒水平與血清Vit A、Vit E水平呈正相關(guān)（r值分別為0.402、0.434，P<0.01），但血清Vit A水平與血清Vit E水平無相關(guān)性（r=0.192，P>0.05）。

在AD組中，血清8-oxo-Gsn水平與年齡呈正相關(guān)（r=0.474，P<0.01），血清硒、Vit A、Vit E水平與年齡均無相關(guān)性（r值分別為0.054、0.020、0.229，P>0.05）；血清硒水平與血清8-oxo-dGsn、8-oxo-Gsn水平均無相關(guān)性（r值分別為-0.105、-0.047，P>0.05），血清Vit A水平與血清8-oxo-dGsn、8-oxo-Gsn水平均無相關(guān)性（r值分別為-0.112、-0.098，P>0.05），血清Vit E水平與血清8-oxo-dGsn、8-oxo-Gsn水平均無相關(guān)性（r值分別為0.116、0.072，P>0.05）。

3 討論

目前，AD已成為全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題。氧化應(yīng)激與自由基損傷可能在AD的發(fā)生、發(fā)展中起主要作用。因此，了解患者體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)對AD的及時干預(yù)、早期防治具有重要意義。已有的研究往往通過討論氧化損傷產(chǎn)物或抗氧化物的某一方面來進行干預(yù)前評估，缺乏對二者的綜合分析。為此，本研究綜合分析了AD患者核酸氧化損傷產(chǎn)物與抗氧化物質(zhì)水平及二者間的關(guān)系，以期對AD的早期干預(yù)和預(yù)防提供幫助。

有研究結(jié)果顯示，8-oxo-dGsn在組織中的累積是AD發(fā)生的早期事件，并貫穿疾病全程[4]。本研究結(jié)果顯示，AD組血清8-oxo-dGsn水平顯著高于正常對照組（P<0.01），提示AD患者體內(nèi)有更嚴(yán)重的DNA分子氧化，與文獻報道[9]相符。本研究正常對照組血清8-oxo-dGsn、8-oxo-Gsn水平與年齡呈正相關(guān)（r值分別為0.449、0.724，P<0.01），提示或可將8-oxo-Gsn和8-oxo-dGsn作為衰老相關(guān)生物標(biāo)志物[7，9-10]；但AD組血清8-oxo-dGsn水平與年齡無相關(guān)性（r=0.113，P>0.05），可能是AD患者氧化應(yīng)激狀態(tài)加重，超過了自然衰老進程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激水平所致[11]。本研究結(jié)果還顯示，AD組與正常對照組血清8-oxo-Gsn水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

本研究結(jié)果顯示，AD組血清硒水平顯著低于正常對照組（P<0.01），對不同年齡研究對象進行進一步的分層分析，AD組各年齡段血清硒水平顯著低于正常對照組同年齡段（P<0.01）。硒在AD病程中最重要的作用是參與構(gòu)成多種酶，參與抗氧化代謝，減少Aβ斑塊形成，緩解tau蛋白過度磷酸化[12]，AD患者體內(nèi)較低的硒水平反映了機體抗氧化物質(zhì)的相對不足[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)AD患者認(rèn)知功能的降低與Vit A缺乏[14]。臨界狀態(tài)的Vit A輕度缺乏也已被證明是AD發(fā)生的危險因素之一[14]。本研究結(jié)果顯示，AD組血清Vit A水平顯著低于正常對照組（P<0.01），且總體水平偏低，接近臨界低值（0.2～0.3 mg/L）[14]，在AD治療過程補充足量的Vit A可能對延緩AD進程有一定作用。盡管Vit E在AD治療中發(fā)揮著重要作用，但本研究AD組與正常對照組之間血清Vit E水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）?？紤]到飲食結(jié)構(gòu)調(diào)整和藥物應(yīng)用對Vit E水平的影響[15]，以及治療方案在臨床應(yīng)用的程度，血清Vit E水平可能無法有效反映AD患者機體原有的抗氧化能力。

本研究的局限性在于AD患者例數(shù)較少，缺乏疾病進程等臨床資料，且高齡患者多合并基礎(chǔ)疾病，如慢性腎病、心血管疾病、糖尿病等，這些疾病往往也涉及氧化應(yīng)激機制。后續(xù)研究將進一步擴大樣本量，收集疾病進程等相關(guān)資料，以進一步明確核酸氧化物質(zhì)及抗氧化物質(zhì)的關(guān)系，及其在AD發(fā)生、發(fā)展中的作用。

綜上所述，AD患者體內(nèi)含有高水平的DNA氧化損傷產(chǎn)物8-oxo-dGsn和低水平的抗氧化物質(zhì)硒。8-oxo-Gsn、8-oxo-dGsn與Vit A、Vit E和硒的關(guān)系及其在AD致病機制中的作用尚需進一步研究。