血紅蛋白、膽紅素、乳糜對干化學法和酶速率法檢測血氨的干擾研究

歐元祝， 龔敬凱， 林斐然， 唐立萍， 朱宇清， 劉 佳， 王華梁

（1.上海市臨床檢驗中心，上海 200126；2. 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心，北京 100039）

氨主要產(chǎn)生于胃腸道，由人體內的氨基酸和其他含氮化合物代謝產(chǎn)生。氨的代謝主要通過肝臟形成尿素來進行。正常人體內血氨含量極低，一旦升高會對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性。臨床血氨檢測主要用于肝性腦病的診斷和治療監(jiān)測。由于各種影響因素的存在，如樣本抗凝劑的使用、運輸和保存的溫度及內源性和外源性物質的干擾，使得血氨成為檢測難度較大的項目[1]。內源性的干擾主要來自患者樣本的溶血、黃疸和脂血，溶血引起的干擾主要來自于紅細胞內高濃度分析物的釋放、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）自身的光譜干擾及干擾分析物檢測的化學反應；黃疸的干擾機制主要是樣本中膽紅素（bilirubin，Bil）濃度升高引起的光譜干擾和化學效應，且結合Bil和未結合Bil的干擾是等效的[2-3]；脂血導致的干擾主要是乳糜微粒和極低密度脂蛋白聚集產(chǎn)生光散射作用造成的樣本混濁[2]。不同抗凝劑的影響及保存溫度的影響已有較多報道[4]，Hb、Bil和乳糜微粒等內源性物質對血氨檢測結果干擾方向和干擾程度的系統(tǒng)研究尚未見相關報道，尤其是對不同檢測方法的干擾影響。目前，臨床測定血氨最常用的方法為酶速率法[谷氨酸脫氫酶（glutamic dehydrogenase，GLDH）法]和干化學法。濕式生化分析儀均采用GLDH法。由于血氨需在采樣后30 min內完成檢測，我國越來越多的醫(yī)院使用干化學分析儀進行血氨測定。本研究擬參考美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP7-A2文件[5]，系統(tǒng)評價內源性干擾物質Hb、Bil和乳糜微粒對GLDH法和干化學法檢測血氨的干擾。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

根據(jù)CLSI EP7-A2文件建議，收集解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心臨床實驗室檢測后的剩余新鮮肝素抗凝血樣本，均無溶血、黃疸和脂血。所有樣本均在采集后15 min內分離血漿。低值樣本：將檢測完畢后的部分剩余血漿立即混合，離心過濾后-80 ℃冷凍保存，血氨濃度為20 μmol/L。高值樣本：將檢測后的剩余血漿在室溫放置約4 h，然后混合，離心過濾，-80 ℃冷凍保存，血氨濃度為80 μmol/L。此2份樣本作為基礎樣本。

1.2 儀器和試劑

Vitros 5600干式生化分析儀（美國Ortho公司）及血氨配套試劑（干化學法，批號101802501826）、校準品（批號05281-B1）、質控品（批號D6163、G6496）。cobas c501全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）及血氨配套試劑（GLDH法，批號342739）、c.f.a.s校準品（批號30559301）。質控品（批號M701051、M701052）購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 干擾樣本的配制 采用干擾檢查A試劑盒（日本Sysmex公司，批號ER8001；干擾物濃度：Hb 46 g/L，未結合Bil 3 089 μmol/L，結合Bil 3 389 μmol/L，乳糜1 534 FTU），參照文獻[3]和文獻[6]的報道，配制5個濃度梯度的Hb、Bil及乳糜干擾樣本，覆蓋輕、中、重度溶血、黃疸及脂血濃度范圍。因結合Bil和非結合Bil的化學特性并不會產(chǎn)生不同的干擾[2-3]，因此本研究對Bil的干擾評價選用未結合Bil。3種干擾物的濃度見表1。

表1 3種干擾物的濃度

1.3.2 干擾實驗 采用干化學法和GLDH法檢測干擾樣本和基礎樣本，重復檢測3次，計算干擾樣本與基礎樣本的相對偏移（高值樣本）和絕對偏移（低值樣本）。檢測樣本前先檢測質控品，以保證檢測質量，所有檢測均在2 h內完成。臨床可接受的干擾偏移范圍采用澳大利亞皇家病理學院（the Royal College of Pathologists of Australasia，RCPA）的允許偏移標準 ：血氨≤30 μmol/L時為±3 μmol/L，血氨>30 μmol/L時為±10%。

2 結果

2.1 Hb對干化學法和GLDH法檢測血氨的干擾

不同濃度的Hb對干化學法檢測血氨高、低值樣本均無干擾，所有偏移均在允許偏移范圍內。Hb對GLDH法檢測血氨高、低值樣本產(chǎn)生負干擾，且干擾程度隨Hb濃度的升高而逐漸增大，在Hb為4.60 g/L時血氨檢測結果已為負值，僅0.92 g/L Hb的偏移在允許偏移范圍內。見表2、圖1。

表2 Hb對干化學法和GLDH法檢測血氨的干擾

圖1 Hb對干化學法和GLDH法檢測血氨的干擾

2.2 Bil對干化學法和GLDH法檢測血氨的干擾

Bil對干化學法檢測血氨低值樣本產(chǎn)生正干擾，當Bil≥184.4 μmol/L時已超出允許偏移范圍；對高值樣本無干擾。不同濃度Bil對GLDH法檢測血氨低值樣本均產(chǎn)生負干擾，對于血氨高值樣本，當Bil≥246.2 μmol/L時對GLDH法產(chǎn)生負干擾。見表3、圖2。

表3 Bil對干化學法和GLDH法檢測血氨的干擾

圖2 Bil對干化學法和GLDH法檢測血氨的干擾

2.3 乳糜對干化學法和GLDH法檢測血氨的干擾

乳糜對干化學法檢測血氨高值樣本無干擾；乳糜濃度為612 FTU時對血氨低值樣本產(chǎn)生正干擾，1 534 FTU時為負干擾。不同濃度乳糜對GLDH法檢測血氨低值樣本均產(chǎn)生負干擾；對于血氨高值樣本，除乳糜濃度為306 FTU時無干擾外，其他乳糜濃度均產(chǎn)生負干擾。見表4、圖3。

表4 乳糜對干化學法和GLDH法檢測血氨的干擾

圖3 乳糜對干化學法和GLDH法檢測血氨的干擾

3 討論

由于樣本的不穩(wěn)定及其他影響因素較多，血氨檢測結果的準確性和穩(wěn)定性一直是臨床檢測中較難解決的問題。本研究采用的GLDH法試劑說明書要求使用乙二胺四乙酸抗凝血漿進行檢測，而本研究收集的血漿樣本均為用于干化學法檢測的肝素抗凝血，采用GLDH法檢測肝素抗凝血漿中的血氨，結果顯示，除導致基礎樣本濃度偏低外，并未影響本研究的干擾試驗。

溶血樣本的干擾作用主要是紅細胞內高濃度成分逸出會增加血漿分析物濃度、Hb對吸光度的干擾、某些細胞成分對化學反應的干擾。正常情況下，血漿中氨處于一個較低的水平，當樣本發(fā)生溶血時，細胞內氨的釋放會直接導致血漿中氨濃度的升高，從而使檢測結果升高。以往報道中的溶血干擾血氨測定的研究均采用模擬臨床溶血樣本進行試驗[7]，尚未見Hb本身對血氨檢測干擾的研究。因此，本研究采用商品化的干擾試劑盒評價Hb、Bil及乳糜對血氨檢測的干擾。由于目前我國及CLIA、美國病理學家協(xié)會（the College of American Pathologists，CAP）均無血氨的允許總誤差和允許偏移標準，所以本研究采用RCPA的允許偏移標準作為評價標準。

本研究所用的GLDH法試劑檢測血氨的原理為：氨在GLDH作用下與酮戊二酸、NADPH反應生成谷氨酸和NADP+，在340 nm處吸光度值的下降與樣本中血氨濃度成正比。干化學法測定血氨的原理為干片比色法，即在干片上涂覆多層分析成分，干片中添加只允許氣體氨通過的半透膜，血漿中的氨離子轉化為氣態(tài)氨后，透過半透膜與顯色劑發(fā)生反應，進而測得血氨濃度。本研究結果顯示，Hb>1.84 g/L時對GLDH法產(chǎn)生明顯的負干擾，且隨Hb濃度的升高，干擾程度逐漸增大。說明盡管溶血時細胞內血氨的釋放會導致血氨檢測結果升高，但Hb本身也會干擾GLDH法中340 nm處的吸光度值，從而導致明顯的負干擾[8]。不同濃度Hb對干化學法檢測血氨無明顯干擾，所有偏移均在允許偏移范圍內。宋玉梅等[9]的研究結果顯示，高Bil會讓血氨的檢測結果明顯低于實際水平，甚至出現(xiàn)負值這種明顯偏離臨床的現(xiàn)象。本研究結果顯示，Bil對GLDH法血氨低值樣本的干擾情況與宋玉梅等[9]的研究結果一致；高Bil對干化學法檢測血氨低值樣本產(chǎn)生了較明顯的正干擾，但Bil對2種方法檢測血氨高值樣本未產(chǎn)生明顯的干擾。本研究結果還顯示，乳糜對GLDH法檢測血氨產(chǎn)生明顯的負干擾，且干擾程度隨乳糜濃度的升高而增大；對干化學法檢測血氨高值樣本無干擾，對血氨低值樣本產(chǎn)生不同方向的干擾（乳糜濃度為612 FTU時為正干擾，1 534 FTU時為負干擾）。

Hb、Bil及乳糜對GLDH法檢測血氨的干擾可能與干擾物質對檢測方法中吸光度值產(chǎn)生影響有關[2，9]。由于濕化學法采用透射光進行檢測，當光線透過樣本時，干擾物質會干擾光線的強度，導致吸光度值受影響，進而影響檢測結果。干化學法特有的多層涂膜及半透膜設計會有效過濾掉乳糜等干擾大分子，同時其反射光檢測的原理也會將一些干擾物質排除在外。因此，在血氨的測定方法中，干化學法對Hb、Bil及乳糜的抗干擾能力優(yōu)于GLDH法，但這些內源性干擾物質均會影響這2種方法檢測血氨的重復性。