呼和浩特地區(qū)腹瀉患者艱難梭菌毒素基因多位點(diǎn)序列分型研究

王艷艷， 王俊瑞， 鄭文琪， 申慧敏， 呂瑩瑩， 郭素芳

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

艱難梭菌（Clostridium difficile）是一種專性厭氧、革蘭染色陽性的粗大芽孢桿菌，是醫(yī)院內(nèi)抗菌藥物相關(guān)腹瀉和偽膜性腸炎的主要病原體[1]。為了解呼和浩特地區(qū)臨床腹瀉患者艱難梭菌感染情況，本研究對臨床疑似抗菌藥物相關(guān)腹瀉和偽膜性腸炎患者糞便樣本進(jìn)行艱難梭菌分離和培養(yǎng)，并檢測艱難梭菌毒素基因，對產(chǎn)毒艱難梭菌進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST），為艱難梭菌感染的診治提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2018年7月—2019年12月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院疑似抗菌藥物相關(guān)腹瀉和偽膜性腸炎成人患者的糞便樣本326份。

1.2 試劑與儀器

艱難梭菌顯色培養(yǎng)基、厭氧產(chǎn)氣袋、VITEK 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀及配套ACT/ANC卡和VITEK MS微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司），Efficiency 96基因擴(kuò)增儀（北京領(lǐng)宇科技有限公司），聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）酶[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)及鑒定 將適量糞便樣本與無水乙醇按1∶1體積混合，靜置1 h后接種于艱難梭菌顯色培養(yǎng)基。35 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。選擇顯色平板上黑色、邊緣不整，有特殊馬糞味的革蘭染色陽性大桿菌進(jìn)行分離純化。采用VITEK 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀和VITEK MS微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定。

1.3.2 毒素基因檢測 采用熱激法提取細(xì)菌DNA，擴(kuò)增艱難梭菌毒素基因（tcdA、tcdB）和二元毒素基因（cdtA、cdtB），明確是否為產(chǎn)毒艱難梭菌菌株。

1.3.3 MLST 參考文獻(xiàn)[1]擴(kuò)增艱難梭菌7個(gè)管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA和tpi）。引物由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)體系：2×pfu Master Mix 25 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物分析：取 5 μL PCR 產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳（180 V，110 mA，20 min），溴化乙錠染色后，在凝膠電泳成像儀下觀察結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物送中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果通過http：//pubmlst.org/clostndium difficile進(jìn)行比對，得到每株菌的ST型別。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定及毒素基因檢測結(jié)果

326份糞便樣本中共分離出艱難梭菌46株（14.11%）。46株艱難梭菌中，有35株為產(chǎn)毒株，其中tcdA（-）、tcdB（+）型3株，tcdA（+）、tcdB（+）型32株，部分菌株電泳見圖1。未檢測到含二元毒素基因的菌株。

圖1 艱難梭菌毒素基因tcdA和tcdB檢測

2.2 MLST結(jié)果

35株產(chǎn)毒艱難梭菌的7個(gè)管家基因目的條帶均清晰可見。MLST比對結(jié)果顯示，35株艱難梭菌共檢出13個(gè)ST型別（2、3、14、33、35、39、42、48、52、54、55、109、512），其中ST54型的菌株數(shù)量最多，有 8 株（22.9%）；其次是ST2型和ST55型，各有5株（14.3%）。未檢測到高產(chǎn)毒株核糖體027型（ST1型）和核糖體078型（ST11型）。其中1株產(chǎn)毒菌株的7個(gè)管家基因擴(kuò)增電泳見圖2。MLST結(jié)果見表2。

圖2 艱難梭菌 MLST管家基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

表2 35株艱難梭菌MLST結(jié)果

3 討論

艱難梭菌為革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，是醫(yī)院獲得性腹瀉最主要的病原菌。當(dāng)廣譜抗菌藥物的應(yīng)用破壞腸道正常菌群平衡時(shí)，產(chǎn)毒艱難梭菌會(huì)過度繁殖，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，并釋放毒素，引起腹瀉。抗菌藥物被認(rèn)為是導(dǎo)致艱難梭菌感染的最大危險(xiǎn)因素[2]。目前，艱難梭菌感染已成為嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題[3]。

不同國家和地區(qū)對艱難梭菌感染的報(bào)道有較大的差異，BAUER等[4]對歐洲34個(gè)國家106所醫(yī)院的艱難梭菌相關(guān)腹瀉流行病學(xué)特征調(diào)查結(jié)果顯示，盡管歐洲各醫(yī)院艱難梭菌相關(guān)腹瀉流行情況有差異，感染率為0～36.3/萬（平均4.1/萬），但總體呈上升趨勢。我國艱難梭菌感染率或分離率為12.6%～18.5%[5-6]。有學(xué)者分析了24家醫(yī)院2009—2015年住院腹瀉患者的病因，發(fā)現(xiàn)19%的腹瀉是由艱難梭菌感染引起的[7]。本研究艱難梭菌檢出率為14.11%。由于艱難梭菌分離培養(yǎng)條件苛刻，對檢測人員要求較高，我國目前只有為數(shù)不多的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室開展了艱難梭菌的常規(guī)分離培養(yǎng)，導(dǎo)致艱難梭菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷不足以滿足臨床診療需求。

艱難梭菌主要產(chǎn)生腸毒素A（tcdA）及細(xì)胞毒素B（tcdB）2種毒素，部分高產(chǎn)毒株還可以產(chǎn)生1種二元毒素（cdtA、cdtB）。本研究共分離出35株產(chǎn)毒艱難梭菌，其中32株艱難梭菌同時(shí)產(chǎn)A、B 2種毒素，3株艱難梭菌只產(chǎn)B毒素。不同地區(qū)報(bào)道產(chǎn)毒類型也不盡相同。本研究產(chǎn)毒艱難梭菌以tcd（A+B+）雙陽為主，未發(fā)現(xiàn)tcd（A+B-）型菌株，與文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道一致，與同俏靜等[10]報(bào)道的54株產(chǎn)毒菌株中有53株tcdB（A-B+），僅1株為tcdA（A+B-），未檢測到雙陽性菌株的研究結(jié)果有差異，可能與不同地區(qū)流行菌株類型不同有關(guān)。

2002年以來，1種高產(chǎn)毒艱難梭菌在北美和歐洲暴發(fā)流行，即PCR-核糖體分型027型/脈沖場凝膠電泳分型NAPl型/限制性內(nèi)切酶分型BI型（簡稱RT027/NAP1/BI）[11-12]。該型菌株引起的臨床癥狀更加嚴(yán)重，且傳播性更強(qiáng)，易復(fù)發(fā)、預(yù)后差，導(dǎo)致艱難梭菌感染發(fā)病率快速增加[12-13]。2005年，在荷蘭又發(fā)現(xiàn)了另1種高毒力菌株——核糖體分型078型[14]。目前，我國有高產(chǎn)毒株、多重耐藥菌株的個(gè)案報(bào)道，但沒有出現(xiàn)艱難梭菌感染的暴發(fā)流行。黃海輝等[15]首次在國內(nèi)分離到高產(chǎn)毒株核糖體078型，我國香港和內(nèi)地也相繼報(bào)道了艱難梭菌高產(chǎn)毒株核糖體027型[16-19]。

MLST是一種基于核酸序列測定的細(xì)菌分型方法。該法通過PCR擴(kuò)增多個(gè)管家基因內(nèi)部片段并測定其序列，分析菌株的變異。MLST操作簡單，結(jié)果能快速得到，并且便于不同實(shí)驗(yàn)室的比較，已經(jīng)用于多種細(xì)菌的流行病學(xué)監(jiān)測和進(jìn)化研究。隨著測序速度的加快和成本的降低，以及分析軟件的發(fā)展，MLST逐漸成為常規(guī)的細(xì)菌分型方法。在我國，引起感染的艱難梭菌主要流行菌株為ST37型、ST35型和ST54型[20-21]。我國東部地區(qū)某教學(xué)醫(yī)院ST81型艱難梭菌在醫(yī)院內(nèi)多病區(qū)播散[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，ST81型艱難梭菌感染者的60 d死亡率明顯高于非ST81型感染患者，而ST81型也占艱難梭菌感染復(fù)發(fā)病例的大部分[23]。

本研究MLST結(jié)果顯示，呼和浩特地區(qū)艱難梭菌ST型別較多，有13種，主要型別是ST54型，其次是ST2型和ST55型。未檢出高產(chǎn)毒株ST1型（核糖體027型）、ST11型（核糖體078型）。本地區(qū)艱難梭菌感染以散發(fā)為主，未出現(xiàn)某一型別的暴發(fā)流行。