健康人血液中人乳頭瘤病毒DNA檢測及定量分析

劉宏錢， 宋朝暉， 梁巧米

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是宮頸癌的重要致病因子[1]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HPV亞型有200多種[2]，其中14種與生殖道癌高度相關(guān)，被稱為高危型HPV[3]。全球范圍內(nèi)70%的宮頸癌是由HPV 16型和HPV 18型導(dǎo)致的[4]。另外，HPV感染也與口咽癌、生殖器疣和皮膚疣等密切相關(guān)；HPV可感染上皮細(xì)胞，其復(fù)制周期與宿主細(xì)胞分化密切相關(guān)[5-7]。高危型HPV感染宮頸上皮細(xì)胞時，病毒通過子宮內(nèi)膜和外子宮頸之間的單層鱗狀細(xì)胞到達(dá)目標(biāo)上皮細(xì)胞[8]。多項(xiàng)對于有高度病變癥狀的患者的研究結(jié)果表明，HPV DNA廣泛存在于生殖道感染患者、宮頸癌患者、口咽鱗狀細(xì)胞癌患者、頭頸部癌癥患者和肛門鱗狀細(xì)胞癌患者血液中[9-13]。此外，也有HPV DNA在人類免疫缺陷病毒感染的兒童外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中被檢出的報道[14]。這些發(fā)現(xiàn)均提示，在癌癥患者的血細(xì)胞中檢測到的HPV可能來源于病變晚期的轉(zhuǎn)移細(xì)胞，或PBMC釋放。健康和無癥狀感染者PBMC中也能檢測到HPV DNA。CHEN等[15]在8.3%的澳大利亞獻(xiàn)血者的血液中檢出HPV DNA，提示PBMC可能是HPV的一個儲存庫和一個潛在的新的傳播途徑。然而，這些初步結(jié)果并沒有被新的研究證實(shí)。因此，對于HPV DNA在健康獻(xiàn)血者PBMC中是否存在，仍需要更加廣泛的研究。本研究旨在通過對獻(xiàn)血人群的PBMC進(jìn)行HPV DNA定量檢測和評估，為血液作為HPV傳播途徑的可能性提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

采集2019年10—12月杭州市第一人民醫(yī)院血液中心207名健康獻(xiàn)血者的血液，獻(xiàn)血者中男94名、女113名，年齡18～60歲。所有獻(xiàn)血者人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和梅毒螺旋體血清學(xué)篩查結(jié)果均為陰性。

1.2 試劑與儀器

LightCycler480熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司），DNeasy Blood & Tissue Kit（德國Qiagen公司），10×SYBR Green qPCR buffer（美國伯樂公司），Taq酶、dNTPs[寶生物（大連）工程有限公司]。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 DNA抽提

取1 mL全血放入含1 mL 0.9%氯化鈉溶液的潔凈玻璃管中，混勻，吸取混勻液，沿管壁緩慢加入到含0.5 mL Ficoll溶液的潔凈玻璃管中。2 300×g離心20 min，吸取中間層白色細(xì)胞（單核個細(xì)胞）于1.5 mL離心管中，13 800×g離心5 min，棄上清液，提取沉淀中的DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行操作。

1.4 HPV-DNA定量檢測

采用LightCycler480熒光定量PCR儀進(jìn)行HPV DNA定量檢測，采用通用引物GP5+/GP6+擴(kuò)增HPV L1基因約150 bp的片段，同時擴(kuò)增內(nèi)參基因β-globin上長度為268 bp的片段，內(nèi)參基因擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)[16-18]進(jìn)行設(shè)計(jì)。PCR體系為50 μL，包括10×SYBR Green qPCR 緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2），1.5 U Taq DNA聚合酶，0.2 mmol/L dNTPs，正、反向引物各0.06 μmol/L，2 μL DNA模板。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃30 s，循環(huán)40次；72 ℃延伸10 min。每個樣本均同時做HPV和內(nèi)參基因平行檢測。

標(biāo)準(zhǔn)曲線用10倍梯度稀釋的、攜帶完整HPV-16基因的SiHa細(xì)胞（分別包含1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×101病毒拷貝）。病毒載量計(jì)算公式為：log（拷貝數(shù)）=-0.277 6×Ct+11.005；r2=0.997 3。該方法的靈敏度為1×101病毒拷貝。HPV病毒載量以每毫升血液中病毒拷貝數(shù)表示。

1.5 HPV-L1基因的擴(kuò)增和測序

使用通用引物GP5+（5'-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3'）和GP6+（5'-GAAAATAAACTGTAAATCATTC-3'）擴(kuò)增HPV-L1基因140～150 bp特異性片段。在反應(yīng)體系為25 μL的Go-Taq Master mix（Promega）中進(jìn)行。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。將測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對。

2 結(jié)果

2.1 獻(xiàn)血者流行病學(xué)特征

207名健康獻(xiàn)血者均未報告明顯或無癥狀的HPV感染。有14名（6.8%）獻(xiàn)血者HPV DNA定量檢測陽性，其中男5名、女9名，年齡（38.7±12.4）歲。

2.2 HPV DNA檢測及分型結(jié)果

用GP5+/GP6+引物從陽性樣本HPV L1基因中擴(kuò)增出140～150 bp的基因組區(qū)域，對擴(kuò)增的特異性片段進(jìn)行Sanger測序，測序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，14例陽性樣本中有7例為單一型別HPV感染，7例為混合感染。單一感染中有3例為16型，其余分別為33型、51型、70型和82型（各1例）。多重混合感染包括5例16型和18型雙重感染，1例51型和59型混合感染，1例16型、32型、35型和66型4重感染。見表1。

表1 健康獻(xiàn)血者HPV DNA陽性樣本型別分布和病毒載量

2.3 HPV病毒載量檢測結(jié)果

所有陽性樣本病毒載量為12.4～39.3拷貝/mL，平均為（21.30±8.27）拷貝/mL。單一型別感染HPV病毒載量為16.8～39.3拷貝/mL；多重混合感染中HPV病毒載量為7.8～24.6拷貝/mL。見表1。

3 討論

眾所周知，上皮細(xì)胞是HPV感染的靶細(xì)胞，病毒復(fù)制與細(xì)胞分化緊密相關(guān)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血液細(xì)胞中也存在HPV DNA[19]。PAO等[20-21]首次在52%（13/25）的泌尿生殖道感染婦女的血液樣本中檢測到多種型別的HPV DNA，在宮頸癌患者的血液中也能檢測到HPV DNA。在宮頸癌前病變、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和口咽癌患者的血清或血漿中都檢測到HPV DNA[22]。這些患者血液中的HPV DNA可能來源于轉(zhuǎn)移性的感染細(xì)胞，或者是HPV感染細(xì)胞存在于血液中，即HPV感染的細(xì)胞會從局部感染部位進(jìn)入患者血液。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，14%（8/57）的人類免疫缺陷病毒陽性的嬰幼兒HPV-16 DNA陽性[14]。這些患兒HPV DNA陽性不能用HPV感染的腫瘤細(xì)胞的存在來解釋。在這種情況下，HPV DNA大概率是通過輸血傳播或者母嬰傳播，提示HPV可通過血液傳播。

目前，僅有2項(xiàng)研究報告了健康人外周血中存在HPV DNA[14-15]。BODAGHI等[14]檢測了19名健康獻(xiàn)血者，其中HPV-16 DNA陽性3名，陽性率為15.8%；他們推測HPV DNA是以游離DNA的形式存在于這些獻(xiàn)血者血液中的。但他們研究中納入的樣本數(shù)偏少，相關(guān)結(jié)論尚需更多樣本和研究來證實(shí)。澳大利亞的1項(xiàng)研究結(jié)果顯示，有8.3%（15/180）的健康獻(xiàn)血者外周血白細(xì)胞中存在HPV DNA，其中高危型占1.7%（3/180）[15]。本研究在健康獻(xiàn)血者的PBMC中檢出了6.8%（14/207）的HPV DNA陽性，其中高危型占92.9%（13/14），遠(yuǎn)高于澳大利亞的研究數(shù)據(jù)[15]。高危型所占比例的差異可能源于不同國家、不同地區(qū)HPV型別的流行性差異。

目前，關(guān)于宮頸癌患者血液中HPV病毒載量的研究比較少，有研究報道的平均值為586拷貝/mL[23]，也有研究報道的平均值為253拷貝/mL[24]，DONG等[25]在血漿樣本中檢測到的平均值為183拷貝/mL。提示HPV病毒載量作為一個潛在指標(biāo)，可應(yīng)用于監(jiān)測宮頸病變進(jìn)程和宮頸癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等。

本研究主要對健康獻(xiàn)血者血液樣本中的HPV載量進(jìn)行了定量分析，之前針對獻(xiàn)血者血液中HPV的研究主要是定性的，未對HPV DNA進(jìn)行定量分析。本研究結(jié)果顯示，獻(xiàn)血者HPV DNA陽性樣本的病毒載量比較低，為12.4～39.3拷貝/mL，平均為（21.3±8.27）拷貝/mL。血液中低病毒載量在臨床上的意義目前尚不清楚，不排除部分健康獻(xiàn)血者存在潛在的生殖道或者其他部位的HPV感染，亦或存在HPV感染史，還需要進(jìn)一步研究。