非痰液樣本結(jié)核分枝桿菌游離DNA檢測在結(jié)核病診斷中的研究進(jìn)展

李靜 張燕 仵倩紅

據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)報道，全球范圍內(nèi)仍有近1/3的結(jié)核病患者未被診斷或報道，漏診或漏報現(xiàn)象在兒童結(jié)核病、肺外結(jié)核和并發(fā)艾滋病患者中尤為明顯[1]。兒童患者的呼吸道樣本多為少菌型，許多HIV感染者也不能獲取到檢測結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)所需的標(biāo)準(zhǔn)呼吸道樣本，均難以實現(xiàn)呼吸道樣本的檢測作用[2]，找到一種快速、低成本的非痰液診斷技術(shù)成為當(dāng)前迫切所需[3]。抗酸桿菌涂片或分枝桿菌培養(yǎng)法一直是結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]，但對于非痰液樣本(如血液、尿液等)，涂片法的陽性率更低，培養(yǎng)周期也過長，均難以滿足臨床檢測的需求。而免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)雖然在診斷敏感性和檢測速度等方面較傳統(tǒng)方法有了很大進(jìn)展，但仍存在成本高、結(jié)果難以規(guī)范化、適用人群不廣泛等諸多問題[5]。游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)的檢測在這種情況下應(yīng)運(yùn)而生，因其具有無創(chuàng)取材、樣本易留取等特點，逐漸受到國內(nèi)外研究人員的重視，成為結(jié)核病非痰液樣本檢測研究的熱點，彌補(bǔ)了特殊結(jié)核病患者診斷的局限性。

一、cfDNA的來源及應(yīng)用現(xiàn)狀

cfDNA是游離核酸的一種存在于生物體液中無細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA片段，有著比DNA更低的相對分子質(zhì)量，常以70～200 bp短片段或21 kb長片段的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物形式存在[6]，被普遍認(rèn)為是細(xì)胞壞死和凋亡過程中釋放出來的[7-10]。細(xì)胞壞死后，由巨噬細(xì)胞對細(xì)胞碎片進(jìn)行消化，從而將DNA片段釋放到血液中；或在細(xì)胞凋亡時，大多數(shù)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，細(xì)胞核固縮，DNA斷裂并釋放入血[11-12]。當(dāng)前，cfDNA廣泛應(yīng)用于病原體檢測、早期產(chǎn)前胎兒基因檢測、卵巢腫瘤、宮頸腫瘤、肝癌或肝相關(guān)性寄生蟲病等[13-17]，且診斷價值較高；而對于結(jié)核病領(lǐng)域，cfDNA的臨床應(yīng)用仍相對較新，目前尚不能直接應(yīng)用于臨床，但較多研究已在人體血液、胸腔積液、腦脊液及尿液等多種體液中檢出cfDNA[18-21]，故認(rèn)為cfDNA檢測在結(jié)核病領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。

二、影響血液和尿液樣本中MTB-cfDNA檢測前處理的因素

cfDNA是一種很有吸引力的檢測和監(jiān)測肺結(jié)核及肺外結(jié)核的生物標(biāo)志物，但對肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者的血液、胸腔積液、腦脊液和尿液等樣本進(jìn)行cfDNA檢測的敏感度和特異度差異較大，分別介于29%～79%和67%～100%之間[18-21]，與WHO對新型結(jié)核病診斷優(yōu)先目標(biāo)產(chǎn)品的性能要求仍有一定差距。這可能與cfDNA半衰期短、穩(wěn)定性較基因組DNA差、檢測方法不一致有關(guān)，且這些研究均側(cè)重于對其方法的對比，對樣本分析前的影響因素涉及較少。

研究表明，在胎兒和腫瘤領(lǐng)域的cfDNA前處理方式不太適用于結(jié)核病領(lǐng)域的研究[22-25]，這使得開發(fā)適用于結(jié)核病檢測的MTB-cfDNA前處理技術(shù)更具潛力。雖然美國Streck公司研發(fā)的BCT采血管可降低基因組DNA的釋放，也可明顯減少背景DNA的干擾，但其成本太高。2016年，Medina等[26]采用BCT采血管與乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)采血管進(jìn)行對比采集血液，室溫保存5 d，發(fā)現(xiàn)EDTA-K2采血管中cfDNA水平明顯升高且穩(wěn)定，但未分析其原因。2018年，Leng等[27]評估了cfDNA濃度及鏈完整性在非小細(xì)胞肺癌與結(jié)核病鑒別診斷中的潛在臨床價值。所有受試者在采樣前均未使用任何抗腫瘤或抗結(jié)核藥物。分別采集受試者5 ml血液于含EDTA-K2的采血管中收集血漿，發(fā)現(xiàn)EDTA-K2可更好地保持cfDNA濃度及鏈完整性，且非小細(xì)胞肺癌患者的cfDNA濃度水平和鏈完整性明顯高于結(jié)核病患者，提示EDTA-K2采血管可提高cfDNA的檢測水平，且cfDNA釋放量在癌性樣本中更多，相較于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物[如CA125、血清神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)]，cfDNA鏈完整性對非小細(xì)胞肺癌和結(jié)核病的區(qū)分效果更高，認(rèn)為cfDNA檢測可作為鑒別結(jié)核病和非小細(xì)胞肺癌的指標(biāo)。

2019年，Murugesan等[28]發(fā)表了對于影響血液和尿液中病原體cfDNA分析前變量的研究。該研究采集健康獻(xiàn)血者的血液和尿液標(biāo)本，并加入MTB-cfDNA制成人工樣本；同時采集結(jié)核病患者的血液和尿液標(biāo)本，通過研究兩種方式在采血管和尿液的保存方式、處理延遲、樣本量、是否凍融等方面的差異，評價影響檢測cfDNA結(jié)果的因素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Streck采血管(含有EDTA-K2抗凝血劑和一種液態(tài)的細(xì)胞防腐劑)和靜脈真空采血管(PAXgene)相比，加入MTB-cfDNA 的EDTA-K2血液采集管可以產(chǎn)生同等數(shù)量或更高水平的MTB-cfDNA；而在尿液中添加防腐劑也可有效防止MTB-cfDNA降解，但其效果要低于25 mmol/L的EDTA。在檢測活動性結(jié)核病患者的血漿和尿液時，EDTA-K2 采集的血液和25 mmol/L EDTA保存的尿液中MTB-cfDNA的釋放量要優(yōu)于Streck采血管，且能在室溫下穩(wěn)定24 h。若在這24 h內(nèi)單次低速離心血液樣本則可明顯增加MTB-cfDNA的釋放量，但尿液樣本的MTB-cfDNA釋放量不受這一操作的影響。同時還發(fā)現(xiàn)，在人工樣本和結(jié)核病患者樣本中，體積量越大的血漿和尿液越可獲得豐度更高的MTB-cfDNA；而在-80 ℃保存24周后的血漿和尿液樣本中，其冷凍和解凍后MTB-cfDNA的豐度水平不受任何影響。故認(rèn)為，將EDTA-K2采血管、單次低速離心及24 h延遲處理相結(jié)合可以產(chǎn)生更多的MTB-cfDNA，而且EDTA-K2管是實驗室中最常見的采血管，其價格低廉，更適合推廣使用。這幾項處理前影響因素進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)了MTB-cfDNA的獲取方式，可為資源有限的廣大研究者提供更好的選擇和研究思路。但這些研究也有一定局限性，具體如下：(1)研究中結(jié)核病患者樣本與人工樣本的結(jié)果非常相似，但并非所有人工樣本的結(jié)果都能得到證實。(2)研究的組別間可能存在重疊，可能造成統(tǒng)計誤差，臨床意義還需進(jìn)一步研究。(3)比較血清或血漿中的MTB-cfDNA時，沒有納入血清采集管、肝素抗凝管，避免因抗凝劑不同而對收集效果產(chǎn)生不同影響。(4)未對超過24 h的前處理進(jìn)行研究。

三、血液及尿液中MTB-cfDNA的提取

cfDNA有著比DNA更低的相對分子質(zhì)量，血漿cfDNA主要是核小體，峰值長度為160～167 bp；而尿液cfDNA的峰值長度是由腎小球濾過功能決定的。這就要求所有尿液cfDNA片段需進(jìn)一步迅速降解[29-32]，使得大部分碎片要低于100 bp，甚至低至30～60 bp[31,33-34]。對cfDNA片段大小的分析是評價cfDNA提取試劑盒的關(guān)鍵，而樣本中cfDNA能否表現(xiàn)出高度片段化則是cfDNA提取的關(guān)鍵。當(dāng)前，市面上研發(fā)出較多提取cfDNA不同片段的產(chǎn)品，然而不同的提取方法對cfDNA的回收率也不同。主要的提取方法有：基于硅膜的旋轉(zhuǎn)柱技術(shù)、基于磁珠的分級篩選法和相分離法[35-36]，而前者是cfDNA提取量最大最純的一種方法，以德國Qiagen公司的QIAamp游離核酸提取試劑盒應(yīng)用最廣泛。

2015年，Mauger等[37]比較了從不同血漿樣品中分離cfDNA的11種提取方法，發(fā)現(xiàn)QIAamp和Norgen游離核酸提取試劑盒的準(zhǔn)確性和重復(fù)性均最好，QIAamp游離核酸提取試劑盒的回收率最高，但因QIAamp試劑盒在cfDNA提取方面具有較大壟斷性，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)成本較高。2018年，我國潘杰等[38]使用國產(chǎn)柱式cfDNA提取試劑盒對血漿cfDNA 提取效率、片段分布(102、268、402 bp)及不同片段DNA的回收率等方面進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)使用國產(chǎn)試劑提取的cfDNA在102、268和402 bp處的條帶強(qiáng)度均明顯高于德國Qiagen公司相關(guān)產(chǎn)品，提示在提取效率上國產(chǎn)試劑可能優(yōu)于Qiagen產(chǎn)品，國產(chǎn)柱式在各項評價性能上均可與Qiagen 產(chǎn)品媲美。但這兩項研究只表明了這些產(chǎn)品在大于100 bp片段中的效果，對于低于100 bp的效果和是否適用于其他樣本并未進(jìn)行研究和說明。

2021年，Vogt等[39]在南非納入9例淋巴瘤并發(fā)HIV感染患者和8例結(jié)核病并發(fā)HIV感染患者，收集全血樣本于細(xì)胞專用管中，評估血漿cfDNA的數(shù)量和質(zhì)量，通過下一代測序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)評估cfDNA的鑒別診斷能力。研究為獲取高質(zhì)量的cfDNA，采用了高敏感度的電泳法來評價cfDNA豐度，將測量90～400 bp內(nèi)具有特征譜的片段指定為cfDNA，將>500 bp的片段指定為基因組DNA。結(jié)果顯示，cfDNA的片段長度是一個限制因素，在400～500 bp間未能檢測到DNA，在200～250 bp間血漿cfDNA的豐度最高，而<100 bp和>250 bp的片段均很少。淋巴瘤患者的顯性cfDNA分子長度為130(95%CI：119.0～136.0)bp，與結(jié)核病患者的長度[139.5(95%CI：119.0～184.0)bp]接近；而繼發(fā)性患者cfDNA分子的中位測量值為236(95%CI：205.0～287.0)bp，低于結(jié)核病患者[252.0(95%CI：222.0～335.0)bp]。定量結(jié)果顯示，cfDNA在淋巴瘤患者中最為豐富，在淋巴瘤患者中cfDNA占所有分離DNA的91%(95%CI：89%～96%)，高于結(jié)核病患者的86%(95%CI：74%～93%)。這項研究結(jié)果為進(jìn)一步研究結(jié)核病患者血液樣本中cfDNA片段長度的選擇提供了有力的依據(jù)，在此基礎(chǔ)上選擇適當(dāng)?shù)臉颖竟苤苯硬杉⑦\(yùn)輸血液樣本至實驗室，有利于分離出高質(zhì)量的cfDNA，可避免低質(zhì)量cfDNA產(chǎn)生假陰性結(jié)果，但由于此研究樣本量太小，限制了對NGS技術(shù)臨床檢測效能的評估，但仍可為研究人員提供一個新的研究思路。

這里特別要提到Oreskovic等[40]于2019年發(fā)表的尿液中小片段cfDNA提取方法的分析研究。這項研究從對片段長度的依賴性、低濃度萃取實驗、不同條件下尿液的耐受性和對PCR抑制的敏感性幾個方面比較了2種已發(fā)表的方案(Wizard/GuSCN和QSepharose)、3種商業(yè)核酸提取試劑盒(Norgen、QIAamp和MagMAX)和1種特異性內(nèi)部序列雜交捕獲技術(shù)的性能分析。研究內(nèi)容如下：(1)選取長度為25、40、80 bp或150 bp的合成DNA靶蛋白，評估尿液cfDNA提取方法對片段長度的依賴性。結(jié)果顯示，每一種提取方法在不同片段長度上的回收率均有所不同。雜交捕獲是惟一能在25～150 bp所有片段長度上保持高回收率(73%～84%)的方法，QSepharose方案對40～150 bp片段也有類似的高回收率(63%～75%)，但對最短的25 bp片段的回收率較低(9%)。Wizard/GuSCN方案依賴于尿液成分，特別是pH值和DNA濃度，即使在調(diào)整尿液到最佳條件下，其回收率仍然很低(9%～17%)。Norgen試劑盒對40～150 bp片段的回收率為30%～41%，對25 bp片段的回收率為72%，說明此種方法更適合于片段較低的尿液樣本。QIAamp試劑盒對150 bp片段的回收率約為18%，且對較短的40 bp和80 bp片段的回收率更低，分別為0.2%和1%，說明這個廣受推薦的商業(yè)試劑盒更適用于血漿而不是碎片較多的尿液。MagMAX試劑盒對150 bp片段的回收率較高(66%)，但隨著片段長度的減少回收率也很快降低，對40 bp片段的回收率幾乎不存在(0.2%)。(2)低濃度萃取實驗：在低濃度樣本中，雜交捕獲和三甲胺基烷基季銨基團(tuán)瓊脂糖凝膠電泳法可快速檢測出所有陽性樣本，而QIAamp和MagMAX試劑盒檢測不出任何陽性樣本。(3)不同條件下(pH值、背景DNA濃度和無機(jī)鹽的變化)，Wizard/GuSCN方案的回收率高度依賴尿液條件，特別是pH值和背景DNA濃度，而無機(jī)鹽的變化對回收率沒有影響；表現(xiàn)為pH值高于6會降低回收率，背景DNA濃度增加會提高回收率，但最大回收率仍遠(yuǎn)低于其他方法，認(rèn)為與其他方法能很好地耐受pH值、背景DNA濃度和無機(jī)鹽的變化有關(guān)。(4)PCR抑制敏感性。雜交捕獲、Wizard/GuSCN、QSepharose和QIAamp檢測對高達(dá)40%的洗脫液均具有抗性，但Wizard/GuSCN和QSepharose 兩種方法的洗脫液隨濃度增加，抗性會減弱。MagMAX在20%洗脫液中受輕度抑制，在40%洗脫液中受嚴(yán)重抑制。Norgen在所有測試條件下均產(chǎn)生抑制，在40%洗脫液下無擴(kuò)增?？傊s交捕獲和QSepharose效果最好，表現(xiàn)為對25 bp和40 bp短片段回收率高，對濃度檢測敏感度高、對不同尿液有一定耐受能力，對PCR抑制有抗性。基于此，兩者已被推薦用于尿液cfDNA的提取，但二者在臨床樣本中的檢測效果仍未明確，期望早日獲得理想效果。

四、cfDNA的檢測方法

隨著現(xiàn)代技術(shù)的不斷應(yīng)用，現(xiàn)已開發(fā)出多種cfDNA檢測技術(shù)，這些方法可在2 d內(nèi)報告結(jié)果，可快速高效地進(jìn)行臨床診斷，目前主要集中為以下兩種：一種是靶向DNA測序技術(shù)，如實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)、數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)、微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)和巢式PCR等[41-43]；一種是非靶向第二代測序技術(shù)，如全外顯子測序和全基因組測序[44]，其中以MTB-cfDNA qPCR在結(jié)核病領(lǐng)域中應(yīng)用最廣，已成為結(jié)核病檢測的常規(guī)方法。

1.血液樣本cfDNA檢測：2017年，Click等[45]納入痰涂片均為陽性且均無分枝桿菌菌血癥的32例HIV感染者和18例非HIV感染者，應(yīng)用MTB-cfDNA qPCR技術(shù)從40例結(jié)核病患者血漿中檢測出18例(45%)陽性，而GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)檢測30份血漿，無一例陽性，表明MTB-cfDNA qPCR檢測血漿診斷結(jié)核病具有可行性，為免疫功能低下的患者創(chuàng)造了新的檢測起點。同年，Yang等[46]通過dPCR技術(shù)也檢測到肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者血液中的cfDNA，表明MTB-cfDNA dPCR檢測對肺外結(jié)核的診斷也有潛在價值。2018年，Yamamoto等[47]應(yīng)用dPCR檢測1例血行播散性結(jié)核病患者中cfDNA的來源，這位患者痰液、血液、尿液標(biāo)本經(jīng)抗酸染色及qPCR均未檢測到MTB，而此次利用dPCR則從血液標(biāo)本中檢測出MTB-cfDNA，且擴(kuò)增陽性，與最終診斷相符合，這為肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷提供了一種新型且侵襲性小的檢測工具。2021年，Pan等[48]納入了24例肺結(jié)核患者和57例結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者(LTBI者)作為研究組和對照組，采用qPCR和ddPCR對血漿樣本進(jìn)行檢測，評估cfDNA對診斷肺結(jié)核的敏感度和特異度，發(fā)現(xiàn)54.2%的肺結(jié)核患者可被檢測到MTB-cfDNA，且MTB-cfDNA陽性與γ-干擾素(IFN-γ)反應(yīng)水平相關(guān)，經(jīng)過抗結(jié)核治療后的患者M(jìn)TB-cfDNA水平明顯下降，表明治療后的結(jié)核病患者M(jìn)TB-cfDNA的釋放量減少。該研究首次在LTBI者血漿標(biāo)本中檢測出cfDNA，提示血漿MTB-cfDNA是一種檢測和監(jiān)測結(jié)核感染與免疫相關(guān)的微生物學(xué)指標(biāo)，但該研究樣本量較小，仍需要大規(guī)模隊列研究來評估血漿cfDNA檢測在有結(jié)核病接觸史和LTBI者治療監(jiān)測中的價值。

2.尿液樣本cfDNA檢測：近兩年，由于尿液樣本易收集、無創(chuàng)性留取的特點，以尿液為基礎(chǔ)的各種診斷方法也成為研究的熱點，尿液MTB-cfDNA則成為一種很有前途的結(jié)核病生物標(biāo)志物，而據(jù)此檢測肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者的敏感度和特異度分別為43%～79%和89%～100%[47]。2021年，MacLean和Nathavitharana[49]回顧性研究了南非和美國地區(qū)的活動性肺結(jié)核患者的73份冷凍尿液樣本。結(jié)果顯示，MTB-cfDNA qPCR檢測的敏感度為83.7%(95%CI：71.0%～91.5%)，特異度為100.0%(95%CI：86.2%～100.0%)，符合WHO公布的性能標(biāo)準(zhǔn)；而對未感染HIV的人群和涂片陰性的結(jié)核病患者檢測的敏感度分別為73.3%(95%CI：48.1%～89.1%)和76%(95%CI：56.5%～88.5%)。研究也指出，獲取尿液MTB-cfDNA 是一個高度復(fù)雜的過程，需要專門的試劑、實驗室設(shè)備和訓(xùn)練有素的技術(shù)人員來完成樣品制備，如果能在檢驗前獲取一份高質(zhì)量的尿液樣本，MTB-cfDNA將會成為一個很好的生物標(biāo)志物。

3.其他非痰液樣本cfDNA檢測：由于兒童結(jié)核病、肺外結(jié)核和艾滋病并發(fā)肺結(jié)核患者不具有特異性的臨床表現(xiàn)，也缺乏敏感的診斷工具，臨床診斷充滿挑戰(zhàn)。在MTB樣本留取過程中，除方便采集的血液和尿液樣本外，其他非痰液樣本中檢測MTB-cfDNA的價值也逐步得到研究。Che等[50]首次在結(jié)核病患者的胸腔積液中檢測出MTB-cfDNA，并將培養(yǎng)法、Xpert法和MTB-cfDNA qPCR檢測進(jìn)行比對分析，三者檢測的敏感度分別為27.1%(95%CI：19.2%～34.9%)、38.5%(95%CI：29.9%～47.2%)和79.5%(95%CI：72.4%～86.7%)。壽娟等[51]檢測結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中的MTB，發(fā)現(xiàn)MTB-cfDNA qPCR法的檢測敏感度(63.11%)明顯高于涂片法(11.65%)，說明qPCR技術(shù)檢測結(jié)核病患者胸腔積液中的cfDNA，是一種快速準(zhǔn)確的診斷方法。Li等[52]也采用涂片法、培養(yǎng)法、Xpert法和MTB-cfDNA qPCR多種方法檢測結(jié)核性腦膜炎患者的腦脊液樣本，發(fā)現(xiàn)他們的檢測敏感度分別為2.2%、13.0%、23.9%和56.5%。Sharma等[53]首次在結(jié)核病患者腹腔積液樣本中檢測出MTB-cfDNA，并參照綜合參考標(biāo)準(zhǔn)(CRS)對qPCR與Xpert法診斷腹部結(jié)核的準(zhǔn)確性進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)qPCR對確定和可能的腹部結(jié)核的診斷敏感度為66.7%(95%CI：40.9%～86.7%)，特異度為97.1%(95%CI：84.7%～99.9%)；而對特異度相近患者的檢測敏感度可提高到70.9%(95%CI：51.9%～85.8%)，而Xpert檢測的敏感度僅為16.7%，但特異度為100.0%(95%CI：89.7%～100.0%)。這些研究均顯示，MTB-cfDNA qPCR檢測結(jié)核病的敏感度遠(yuǎn)高于其他方法，且陽性檢出率明顯提高，是一種準(zhǔn)確的分子檢測方法，可為MTB的病原學(xué)檢測提供直接證據(jù)。

2021年6月發(fā)表了一篇應(yīng)用MTB-cfDNA診斷結(jié)核病有效性的系統(tǒng)回顧性薈萃分析[54]，該分析包括了15項在結(jié)核病流行地區(qū)進(jìn)行的研究，其中13項在中國、1項在印度、1項在南非；主要使用血液、尿液、腦脊液、胸腔積液和腹腔積液等非痰液樣本；共納入18篇文章，其中14篇是cfDNA與綜合參考標(biāo)準(zhǔn)(CRS)比較的獨(dú)立研究，4篇是與MTB培養(yǎng)法比較的獨(dú)立研究。相較于綜合參考標(biāo)準(zhǔn)和培養(yǎng)法結(jié)果，MTB-cfDNA檢測的敏感度、特異度、曲線下面積(AUC)分別為68%、98%、0.97和48%、91%、0.88，各研究間雖異質(zhì)性明顯，但這些結(jié)果均表明cfDNA檢測對診斷結(jié)核病的準(zhǔn)確性明顯優(yōu)于綜合參考標(biāo)準(zhǔn)和培養(yǎng)法，對肺結(jié)核和肺外結(jié)核具有良好的診斷性能，且可用于結(jié)核病的早期快速診斷。但這些研究的主要對象為成年人，仍缺乏兒童患者相關(guān)數(shù)據(jù)。另外，該研究結(jié)果顯示，檢測結(jié)核性胸膜炎中cfDNA的診斷價值最高，其次是結(jié)核性腦膜炎和腹部結(jié)核，雖然這幾項研究樣本量均較少，但不可否認(rèn)，cfDNA檢測有望成為少菌型結(jié)核病的有效診斷方法，為臨床診斷結(jié)核病提供強(qiáng)有力的輔助支撐。

五、總結(jié)與展望

結(jié)核病仍然是全球衛(wèi)生問題的一個重大挑戰(zhàn)，雖然痰液和灌洗液是診斷結(jié)核病的傳統(tǒng)樣本，但難以用于兒童結(jié)核病、肺外結(jié)核、艾滋病并發(fā)肺結(jié)核和無痰/少痰者，且肺泡灌洗液取材具有侵入性，患者耐受性差。而MTB-cfDNA qPCR檢測技術(shù)是以非痰液樣本為檢測基礎(chǔ)，具有廣泛的應(yīng)用前景。盡管目前還沒有該技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的共識或指南，也在結(jié)核病研究領(lǐng)域中處于起步階段，但近兩年已在血液和尿液樣本的前處理及提取方面取得了很大突破，可通過PCR技術(shù)檢測結(jié)核病患者的血液、尿液等非痰液標(biāo)本中的cfDNA，并獲得較高的敏感度。然而，作為一種新型的分子標(biāo)志物檢測仍存在一些亟待解決的問題，一是提取早期患者的cfDNA難度較高，穩(wěn)定性較差，需消耗大量的精力和物力，且缺乏對提取物標(biāo)準(zhǔn)化和科學(xué)的質(zhì)量控制，尚不能指導(dǎo)臨床應(yīng)用。但不可否認(rèn)，在具備合適的前處理、提取方法和檢測方法的基礎(chǔ)上，cfDNA檢測仍具有巨大的研究潛力。二是cfDNA檢測可能在有結(jié)核病治療史的患者中特異度較低，其良好生物學(xué)特性可能僅適用于活動性結(jié)核病患者和LTBI者，相信在進(jìn)一步的研究中一定能開啟結(jié)核病快速診斷的新篇章。