低共熔溶劑解離木纖維時木質素縮合對纖維素酶解的影響

余燕燕，李以琳，樓雨寒，劉永壯，于海鵬

(東北林業(yè)大學材料科學與工程學院，生物質材料科學與技術教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

木質資源是地球上儲量極為豐富的可再生能源原料，尤其是林木剩余物，每年產(chǎn)量達3億t[1]，其利用率通常不高且直接焚燒會污染環(huán)境。木質資源主要由45%纖維素、30%半纖維素和25%木質素組成，將其轉化為能源產(chǎn)品和平臺化學品等[2-4]以供分級利用，可極大提高木質資源組分的利用率和附加值。其中，由木質纖維素生產(chǎn)生物乙醇是木質資源進行高附加值利用的途徑之一，但實現(xiàn)木質組分分級利用要解決的關鍵問題是打破木質組分間的抗解聚屏障，并抑制分離木質素在纖維素表面的縮合吸附。

木質資源的這種天然抗解聚屏障，阻礙了對性質各異的木質組分進行分級利用，嚴重降低了木質資源的利用效率。針對抗解聚屏障問題，國內(nèi)外研究者相繼提出了各種解離策略，如酸法、堿法、有機溶劑法、離子液體法等[5-6]，可有效地將纖維素、半纖維素和木質素分離出來。而影響木質組分高效利用的因素除了木質纖維固有的生物抗解聚屏障，還有分離過程中組分間的縮合吸附，如對纖維素進行酶解時，其表面未脫除干凈的木質素會與纖維素酶形成非生產(chǎn)性吸附[7]，明顯降低纖維素的酶解效率。為進一步提升木質組分的分離轉化效率，各學者同時也結合了微波輔助、添加催化劑、供氫加壓等附加手段[8-9]，使得分離組分的利用效率明顯提高。這些方法各有利弊：酸堿法提取出的纖維素純度高，利于酶解，但其他組分作為廢液處理會污染環(huán)境且造成資源浪費；有機溶劑較為溫和，但提取過程煩瑣，不便于操作，部分有機溶劑的大量使用還會危害人體健康；離子液體作為一類高效提取纖維素的溶劑，存在成本過高、難以實現(xiàn)工廠化利用的問題?；趯Νh(huán)境保護、操作簡便安全、低成本的需求，提出一種高效綠色的木質組分分離方法對纖維素的充分利用至關重要。

近年來，無毒、可降解的低共熔溶劑(deep eutectic solvent, DES)被發(fā)掘出來[10]，因其選擇性溶解多糖和木質素的特點，被廣泛應用于木質資源的分離提取[11-12]。Liu等[13]采用氯化膽堿/草酸DES結合微波輔助的方式僅需3 min即可實現(xiàn)纖維素和木質素的高效分離。Chen等[14]在此基礎上將去除了木質素和木糖的芒草、柳枝和玉米秸稈進行酶解處理，發(fā)現(xiàn)分離纖維素的酶解效率較原料的直接酶解提升了2～5倍。Lin等[15]通過調節(jié)氯化膽堿/乳酸的比例，在130 ℃下對竹渣進行預處理，能得到76.9%的酶解效率，具有發(fā)酵為生物乙醇的能力。在采用酸性DES分離木質組分過程中發(fā)現(xiàn)，木質素側鏈在酸性高溫環(huán)境下，會產(chǎn)生大量的自由基，易與自身或相鄰木質素結構形成C—C連接，使木質素發(fā)生縮合[16]，縮合后的木質素分子量增大、活性較低、難以溶解，這種木質素吸附在纖維素表面不能與纖維素酶反應，同時阻礙了纖維素酶接觸纖維素和半纖維素，會限制酶解產(chǎn)率的提升[17-18]，目前關于這方面尤其對纖維素酶解影響的研究尚不深入。

為探究DES煉制過程中木質素的縮合吸附對纖維素固含物酶水解的影響，以氯化膽堿/二水草酸DES為預處理溶劑，在110 ℃下油浴加熱處理楊木木粉，分離得到纖維素固含物和木質素，對固含物的形貌和性質進行性能測試，表征木質素的結構變化。同時采用纖維素酶對固含物進行酶解處理，測定固含物的糖轉化效率。探究不同預處理時間下，殘留的木質素對纖維素酶解效率的影響規(guī)律，為后續(xù)提高木質原料分離纖維素的酶解產(chǎn)率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

楊木(PopulusL.)木粉，購自哈爾濱帽兒山林場，過60目篩(孔徑為0.25 mm)后，經(jīng)苯醇抽提后干燥備用。

氯化膽堿、二水草酸、無水乙醇、冰乙酸、乙酸鈉，均為分析純，購自阿拉丁試劑有限公司；濃硫酸(質量分數(shù)98%)，購自天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；纖維素酶CTec2，生物純，酶活為145 FPU/mL，購自諾維信(中國)生物科技有限公司。

W-201C型數(shù)顯恒溫油浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，SHZD(Ⅲ) 型循環(huán)水式真空泵(上海道京儀器有限公司)，DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱和DKZ-1型恒溫振蕩水槽(上海一恒科學儀器有限公司)，CJJ791型磁力攪拌機(金壇市國旺實驗儀器廠)，F(xiàn)A2004B型電子天平(上海精科天美科學儀器有限公司)，WB-2000A型旋轉蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 低共熔溶劑配制及木質纖維解離處理

根據(jù)前期對氯化膽堿/二水草酸DES的溶劑組分間相互作用的模擬計算及實際處理木粉的作用效果，發(fā)現(xiàn)氯化膽堿/二水草酸摩爾比為1∶1時，對于解離木質纖維并兼顧溶劑利用率是較為合適的選擇[19-20]。稱取27.8 g的氯化膽堿和25.2 g的二水草酸，于80 ℃油浴加熱，轉速為300 r/min，加熱攪拌形成均一透明的DES。將2.0 g干燥好的楊木粉加到已配好的DES中，在110 ℃下加熱DES和楊木粉的混合物，攪拌加熱1 h，轉速維持在300 r/min。加熱完畢后取出冷卻，用400 mL乙醇水溶液(V乙醇∶V水=7∶3)將反應液轉移至500 mL的燒杯中，室溫下攪拌2 h后進行真空抽濾，將分離出的纖維素固含物放入60 ℃烘箱中干燥，濾液收集于圓底燒瓶中，在50 ℃加熱條件下旋轉蒸發(fā)出乙醇，向濃縮液中加入適量水，使木質素沉淀，真空抽濾得到分餾木質素，濾液留存?zhèn)溆肹20]。之后將處理時間分別調整為3和5 h，對應處理編號見表1。

表1 不同處理條件下對應組分編號Table 1 Corresponding component numbers for different treatment conditions

1.3 纖維素的酶解

稱取0.200 0 g纖維素固含物，加入7.50 mL緩沖液(乙酸鈉緩沖液，pH為5)，再加入0.002 8 g鹽酸四環(huán)素，最后加入0.02 mL的CTec2纖維素復合酶，在50 ℃下水浴振蕩，每隔一定時間取0.20 mL酶解液高溫滅活，通過液相測定糖含量[7]。

1.4 性能測試

1)纖維素固含物和木質素宏觀形貌：通過華為STK-AL00型手機拍攝相應樣品的數(shù)碼照片，手機像素為4 800萬。

2)組分含量測定：參照NREL/TP-510-42618《生物質結構碳水化合物和木質素的測定》，結合Agilent 1260型高效液相色譜儀(HPLC)測定處理前后固含物中纖維素、半纖維素和木質素的含量，利用葡萄糖和木糖標準曲線，以葡萄糖質量濃度測定纖維素含量，以木糖為代表測定半纖維素含量變化。流動相為4 mmol/L的硫酸溶液，采用Aminex HPX-87H有機酸分析柱(長×孔徑=300 mm×7.8 mm, 填料粒徑5.0 μm)和示差檢測器測試，柱溫50 ℃，進樣量20 μL。

3)X射線衍射(XRD)測試：采用荷蘭帕納科公司生產(chǎn)的XPert 3 Powedr型X射線衍射儀對所提取出的纖維素固含物樣品進行結晶度測試，掃描角度為10°～45°，步長為0.05°。

4)掃描電子顯微鏡(SEM)測試：通過美國FEI公司的QUANTA200型電子掃描顯微鏡對所提取出的纖維素固含物樣品微觀形貌進行表征。

5)木質素結構測定：將60 mg木質素溶解在0.6 mL氘代丙酮中，由布魯克科學儀器有限公司的核磁共振波譜儀測定木質素的結構變化。13C和1H 維度的光譜寬度分別為20 000和5 000 Hz。1H維度的采樣點數(shù)為2 048，循環(huán)延遲為1.5 s，累加128次，在13C維度采樣點數(shù)為256，碳氫耦合常數(shù)為145 Hz，在傅里葉變換之前，13C維度中的1 024個數(shù)據(jù)點由零填充。木質素的各結構含量變化是通過二維核磁譜圖(2D NMR)中對應信號的積分面積大小來反映的，為更加直觀地反應不同結構單元及連接鍵的變化情況，據(jù)文獻[21]計算出各結構的占比。木質素芳香單元縮合含量計算如下：

芳香單元總量=(S2/6+S′2/6)/ 2 +S縮合+(G2+G5+G6)/ 3 +PB

(1)

S縮合%=S縮合/芳香單元總量×100

(2)

式中：S2/6為紫丁香基芳香環(huán)中2, 6位置處的C—H信號積分數(shù)值；S′2/6為氧化的紫丁香基芳香環(huán)中2, 6位置處的C—H信號積分數(shù)值；S縮合為紫丁香基芳香環(huán)中縮合位置的C—H信號積分數(shù)值；G2為愈創(chuàng)木基芳香環(huán)中2位置處的C—H信號積分數(shù)值；G5為愈創(chuàng)木基芳香環(huán)中5位置處的C—H信號積分數(shù)值；G6為愈創(chuàng)木基芳香環(huán)中6位置處的C—H信號積分數(shù)值；PB為對羥基苯甲酸酯芳香環(huán)中2, 6位置處的C—H信號積分數(shù)值。

2 結果與分析

2.1 固含物性質表面狀態(tài)

經(jīng)氯化膽堿/二水草酸DES處理后，分離出來的固含物較原料發(fā)生了明顯變化。由圖1可以看出，預處理時間越長，所得到的固含物顏色越深，從淡黃色變?yōu)楹诨疑?；楊木木粉由大顆粒逐漸變小，干燥的固含物由松散顆粒(CO-1R)變?yōu)榫奂瘔K狀(CO-3R、CO-5R)，尤其是處理5 h后的固含物CO-5R，顏色發(fā)黑，質地較硬。表明這種DES在分離出纖維素固含物時，會使纖維素表面產(chǎn)生一些有色吸附，與分離出的木質素CO-5L顏色相近，這些有色吸附物可能為縮合的木質素或纖維素和半纖維素降解形成的假木質素[22]。其次，經(jīng)過氯化膽堿/二水草酸DES處理后，固含物得率隨處理時間延長而逐步下降，表明長時間的加熱處理可能脫除了木粉中更多的木質素，或是纖維素和半纖維素這些多糖分子在酸性DES中發(fā)生降解溶于濾液里。

圖1 DES處理后纖維素固含物的數(shù)碼照片及得率Fig. 1 Digital photographs and yield of cellulose solids after DES treatment

2.2 固含物組分含量

為驗證固含物中各組分的變化，對纖維素固含物進行組分含量的測試，結果見圖2。楊木木粉中含有21.0%±1.7%的木質素，基于所有原料中各組分的含量，計算出不同處理下纖維素和半纖維素的保留率及木質素的去除率，經(jīng)氯化膽堿/二水草酸DES處理后，木質素去除率接近80.0%。但隨著處理時間的延長，木質素的去除率并沒有提升，反而略有下降，表明延長加熱時間并沒有去除更多的木質素，這可能是木質素縮合后吸附在纖維素表面，導致固含物中木質素殘留增多。同時，隨著處理時間延長，纖維素的保留率由91.8%下降至72.7%；半纖維素保留率由20.4%下降至6.1%。表明纖維素和半纖維素在這類酸性DES中不穩(wěn)定，長時間加熱處理會導致其降解。降解的纖維素和半纖維素的量要多于木質素縮合附著的量，從而導致固含物整體得率下降，固含物組分含量中纖維素和半纖維素的降解量與固含物得率減少量趨勢幾乎一致，且降解的糖類物質溶于DES及乙醇水溶液等，故吸附在纖維素表面的有色物質多為縮合的木質素。

圖2 DES處理后木質素的去除率和固含物中纖維素、半纖維素的保留率Fig. 2 Lignin removal and retention of cellulose and hemicellulose in solids after DES treatment

2.3 固含物的結晶度

固含物的XRD圖和結晶度見圖3。由圖3a可以看出，去除了大量木質素和半纖維素后，纖維素固含物在2θ=15.8°和2θ=22.5°有明顯的纖維素特征衍射峰，表明該固含物中纖維素仍為天然Ⅰ型結晶結構，即氯化膽堿/二水草酸DES處理手段并沒有改變纖維素的晶型。采用Segal法計算原料木粉及不同預處理時間下纖維素固含物的相對結晶度，結果見圖3b。相較于原料，處理后纖維素固含物CO-1R的相對結晶度由63.4%提升至75.7%，但隨預處理時間延長，CO-3R與CO-5R的結晶度逐漸下降，分別為72.6% 和70.1%，與2.2部分組分含量中提到的纖維素發(fā)生降解的分析結果一致。表明氯化膽堿/草酸DES預處理楊木木粉1 h時，DES能有效解離木質纖維，去除部分半纖維素、木質素以及非結晶區(qū)的纖維素，從而顯著提高纖維素固含物的結晶度。隨處理時間的延長，酸性DES開始解離纖維素的結晶區(qū)，同時縮合的木質素也附著在纖維素表面難以去除，因此固含物的結晶度有所降低。

圖3 DES處理后纖維素固含物的XRD圖及相對結晶度Fig. 3 XRD pattern and relative crystallinity of cellulose solids after DES treatment

2.4 分餾木質素結構性質

對分餾木質素進行二維核磁測定，相應核磁譜圖(圖4)中信號歸屬參照文獻[20]。隨氯化膽堿/二水草酸DES處理時間的延長，木質素側鏈區(qū)某些信號逐漸消失[20]，如代表β-O-4α(δC/δH=73.0～77.5/4.8～5.1)結構的相關信號在處理時間延長到3和5 h后消失，同樣在δC/δH=86.5～89.5/4.6～4.8 和72.5～76.0/3.8～4.3處的β-βα和β-βγ結構的交叉信號也消失了，而對于δC/δH=66.0～68.0/4.2～4.3和62.0～64.5/3.5～4.0處代表的HKγ和β-5γ結構信號逐漸減弱，圖譜中β-5β和β-O-4γ對應的信號沒有明顯變化。以上結果表明氯化膽堿/二水草酸DES處理使得木質素部分側鏈結構斷裂。在芳香區(qū)具有紫丁香基(S)、愈創(chuàng)木基(G)和對羥基苯甲酸酯(PB)等木質素的基本結構單元相應信號。隨著處理時間延長，芳香環(huán)信號逐漸減弱，同時出現(xiàn)明顯的S型縮合信號(δC/δH=106.0～109.0/6.4～6.7)，經(jīng)計算，木質素的縮合率由CO-1L的32.8%逐漸升高至50.9%。相關研究表明，在這種酸性加熱環(huán)境下，木質素側鏈處羥基易發(fā)生脫水反應，產(chǎn)生大量不穩(wěn)定的碳正離子，與相鄰木質素分子或分子內(nèi)側鏈處形成新的C—C鍵連接，產(chǎn)生縮合木質素[16,20]。由此表明，氯化膽堿/二水草酸DES在解離木質組分之間的連接，分離出木質素的同時，也將木質素的部分側鏈區(qū)結構斷裂了，側鏈斷開的木質素分子又重新形成分子內(nèi)或分子間的C—C鍵和C—O鍵，使木質素發(fā)生縮合。

圖4 DES處理后分餾木質素二維核磁譜圖及其對應結構單元Fig. 4 2D NMR spectrum of fractionated lignin after DES treatment and its corresponding structural units

2.5 固含物微觀形貌

使用SEM觀察纖維素固含物表面的微觀形貌，結果見圖5。由高倍掃描電鏡圖片可以看出，原始楊木木粉表面呈現(xiàn)密實的塊狀結構(圖5a)，經(jīng)氯化膽堿/二水草酸DES處理1 h后，固含物表面出現(xiàn)部分球狀顆粒(圖5b)，可能為木質素殘余物或降解的糖類物質所形成的假木質素。隨著處理時間的增長，CO-3R纖維素表面均勻分布著更多的球狀小顆粒，處理時間達到5 h時，固含物CO-5R表面小顆粒聚集為大顆粒(圖5d)。結合前面木質素結構及固含物組分分析，表明固含物變黑主要是由于顯色的木質素發(fā)生了縮聚反應，附著在纖維素表面。

a) 原料；b) CO-1R；c) CO-3R；d) CO-5R。圖5 DES處理前后固含物表面的高倍掃描電鏡圖片F(xiàn)ig. 5 High magnification SEM images of the solids surface before and after DES treatment

2.6 固含物酶解效率

對固含物各項性質的測定表明，經(jīng)氯化膽堿/二水草酸DES處理后，分離得到的固體剩余物中含有大部分的纖維素，這些纖維素能通過酶解轉化為葡萄糖。為探索纖維素表面的縮合木質素對固含物酶解效率的影響，進行酶解實驗。結果表明，經(jīng)氯化膽堿/二水草酸DES處理后，固含物的酶解效率較原料提升了3倍以上，葡萄糖的酶解產(chǎn)率由19.7%提升至73.3%(圖6a)；木糖的酶解產(chǎn)率從原料的11.1%提高到98.7%(圖6b)。處理不同時間，所得固含物的酶解效果不同，木糖的產(chǎn)率隨處理時間的延長而逐步提升，葡萄糖的產(chǎn)率隨處理時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。結合固含物的狀態(tài)及木質素的結構分析，表明短時間的氯化膽堿/二水草酸DES處理能有效破除木質纖維的生物抗解聚屏障，去除大量木質素，增加纖維素與纖維素酶的可及度，促進纖維素固含物的酶解，故處理后的固含物酶解產(chǎn)率較原料高出3倍以上。木糖產(chǎn)率隨時間延長而逐步增加，是由于半纖維素本身聚合度和結晶度較低，DES處理對半纖維素的降解作用使得其含量顯著減少，散落在外部的半纖維素受木質素縮合的影響較小。葡糖糖產(chǎn)率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，這可能歸因于兩個主要因素：一方面是內(nèi)部的纖維素，隨處理時間的延長，木質纖維的物理結構解離得更加完全，能夠暴露出更多的活性位點與纖維素酶接觸，提高了纖維素的可及度以提升酶解效率；另一方面，纖維素表面的木質素縮合也在逐漸增加，對纖維素酶造成較多的非生產(chǎn)性吸附[23]，覆蓋了部分裸露出來的活性位點，制約了纖維素的葡萄糖轉化效率。在處理時間為3 h時，木質素縮合所造成的抑制作用不足以與纖維素可及度增加的促進酶解效力抗衡；處理時間達到5 h時，木質素縮合程度進一步增加，所具有的抑制作用強于此時的促進作用。故而葡萄糖產(chǎn)率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。

圖6 DES處理后固含物的酶解效率 Fig. 6 Enzymatic efficiency of the solids after DES treatment

2.7 木質素縮合與酶解效率

木質素縮合率與纖維素酶解效率之間的相關關系見圖7。由圖7可以看出，隨著木質素縮合率的升高，纖維素固含物的酶解效率受到限制，前面的分析表明，處理時間為3 h時，纖維素固含物的細碎形貌和下降的結晶度等都是非常利于纖維素酶解的，其酶解效率較CO-1R有9.0%的提升達到73.3%，而當處理時間到達5 h時，固含物的酶解效率僅為66.6%，這可能是因為木質素的縮合和不良吸附。在不同的處理時間過程中，木質纖維解離更加完全及纖維素結晶度下降等有利于酶解的因素與木質素縮合這一不利因素呈現(xiàn)出一種競爭狀態(tài)，在3 h以內(nèi)時有利因素占主導，使得纖維素酶解效率略有提升；到達5 h時，木質素縮合對纖維素酶解的抑制作用遠強于有利因素，故酶解效率明顯下降。若能有效解決固含物表面木質素的縮合吸附問題，纖維素固含物的酶解效率將不僅僅停留于CO-3R的73.3%。為驗證這一結論，借鑒文獻報道乙二醇(ethylene glycol，EG)具有增強去除木質素和抑制木質素縮合的效果[24-25]，在目前所用二元DES基礎上加入了0.1 mol抑制木質素縮合的乙二醇分子，組成三元DES，對楊木木粉進行同樣的加熱處理5 h，木質素去除率增加了10.6%，相應的縮合率及酶解產(chǎn)率如圖7所示?？梢钥闯?，添加了抑制木質素縮合的乙二醇分子后，木質素縮合率從50.9%下降至38.2%，酶解效率從66.6%提升至94.7%。以上表明纖維素表面的木質素縮合吸附對纖維素酶解的抑制作用。

圖7 木質素縮合率與纖維素酶解效率的關系Fig. 7 Relationship between lignin condensation rate and cellulase digestion efficiency

3 結 論

1)氯化膽堿/二水草酸DES處理手段，能有效從楊木木粉中分離出纖維素固含物和木質素。隨著處理時間的延長，纖維素和半纖維素發(fā)生了降解，木質素產(chǎn)生縮合。

2)去除了大部分木質素的纖維素固含物是一種很好的酶解原料，與原料木粉相比，該固含物的酶解產(chǎn)率得到了大幅提升，由19.7%提高至73.3%。

3)長時間的氯化膽堿/二水草酸DES加熱處理導致木質素縮合并吸附在纖維素表面，是引起纖維素固含物酶水解得率下降的重要原因之一。