液態(tài)活檢在胰腺癌早期診斷中的作用

熊光冰 王敏 朱峰 秦仁義

胰腺癌是一種臨床發(fā)現(xiàn)晚、惡性程度高和預后差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。其中，最常見的病理類型為胰腺導管腺癌。流行病學研究表明，其5年總體生存率在9%以下，分別位居我國和美國惡性腫瘤致死因素的第6位和第4位，并呈逐年上升趨勢，預計于2030年成為美國第2位的腫瘤相關(guān)死亡原因[2]。根治性手術(shù)切除是胰腺癌目前唯一可能的治愈手段，但80%左右的病人在初次就診時已不可切除或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[3]?；熓歉纳撇荒苁中g(shù)病人預后的重要治療策略，然而以吉西他濱為基礎(chǔ)的單藥或聯(lián)合用藥方案并沒有大幅度延長病人的總體生存時間，大部分晚期病人的中位生存時間仍小于1年。究其原因，早期臨床癥狀不典型、缺乏靈敏且特異的早期診斷標志物是主要因素[4]。因此，研究用于胰腺癌病人早期診斷的腫瘤標志物，以提高早期診斷率和手術(shù)可切除率，對于改善病人預后具有重要的臨床意義。

目前，臨床上診斷胰腺癌的常用方法包括血液學檢測、影像學檢查及組織病理學分析。CA19-9是唯一被美國食品藥品管理局批準用于胰腺癌診斷的血液學檢測標志物，但隨著對CA19-9的深入研究發(fā)現(xiàn)，CA19-9及其他消化道腫瘤標志物(如CEA、CA125、CA72-4等)對于胰腺癌早期診斷的靈敏度與特異度均不高，甚至在與慢性胰腺炎的鑒別診斷中可產(chǎn)生假陽性結(jié)果[5-6]。增強CT(contrast-enhanced computed tomography)和核磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)是臨床上常用的影像學檢查手段，但現(xiàn)有的研究證據(jù)表明，二者在胰腺癌早期診斷方面存在不足[6-7]。而在診斷方面具有較高靈敏度的正電子發(fā)射計算機斷層顯像(positron emission tomography/CT，PET/CT)因其昂貴的檢查費用限制了其廣泛的使用[6,8]。內(nèi)鏡超聲引導下的細針穿刺(endoscopic-ultrasound guided fine-needle aspiration,EUS-FNA)是目前胰腺癌診斷的金標準，文獻報道其靈敏度和特異度可高達86.8%和95.8%[9-10]。然而，一方面由于EUS-FNA屬于復雜的侵入性操作，不僅具有操作并發(fā)癥發(fā)生的可能(如腫瘤播散、胰腺炎、出血及消化道穿孔等)，還不易多次重復進行或部分病人不能滿足操作要求；另一方面，因為胰腺癌特有的腫瘤間質(zhì)成分，EUS-FNA僅能提供有限的腫瘤細胞進行病理相關(guān)細胞學分析，往往可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，且不能提供充足的組織完成腫瘤分子生物學研究以指導治療策略的選擇；從而導致EUS-FNA在胰腺癌診斷上的應(yīng)用受限。因此，臨床上迫切需要新技術(shù)或新的生物標志物用來輔助胰腺癌的早期診斷，并克服與侵入性檢查相關(guān)的禁忌證。近年來的研究表明，液態(tài)活檢(liquid biopsy,LB)作為一類新興且熱門的非侵入性檢測技術(shù)，主要從病人血液中獲得腫瘤的相關(guān)信息，主要包括循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating- tumor DNA,ctDNA)及外泌體(exosomes)等的檢測[4,11]，不僅在胰腺癌早期診斷中發(fā)揮潛在的優(yōu)勢，還可對病人的預后判斷以及復發(fā)監(jiān)測有一定的指導意義。

一、液態(tài)活檢的主要檢測內(nèi)容

1.CTCs:CTCs于1869年被首次報道[12]，是指實體腫瘤因生長、或腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、或外科手術(shù)操作擠壓等原因，使部分腫瘤細胞穿過基底膜、細胞外基質(zhì)及血管管壁等，從而進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞[13]。其在外周血中數(shù)量罕見，每1×108個血細胞中約含一個，常呈現(xiàn)為單個細胞或細胞簇，大小為毛細血管徑的2 ～ 4倍左右。近年來的研究表明，CTCs檢測在胰腺癌的早期診斷方面扮演著重要角色，一方面腫瘤細胞可通過EMT過程在胰腺癌發(fā)生發(fā)展的最初始階段就播散入血，如Rhim等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌小鼠模型轉(zhuǎn)化過程中，CTCs早于腫瘤組織病變?yōu)榍忠u性原位癌而出現(xiàn)在外周血中，且CTCs在未惡變?yōu)橐认侔┑?1例胰腺囊性疾病病人的外周血中有7例可檢測出CTCs的相關(guān)標志物[15]。另一方面，現(xiàn)有的研究證據(jù)表明，CTCs與胰腺癌的原發(fā)灶和/或轉(zhuǎn)移灶中的腫瘤細胞在基因組學和蛋白質(zhì)組學方面存在相關(guān)性；可通過相關(guān)新興技術(shù)對病人外周血中富集而來的CTCs進行深入的DNA、RNA及蛋白質(zhì)等分子標志物檢測分析以達到早期診斷目的[16-17]。

2.循環(huán)腫瘤DNA:ctDNA是腫瘤在發(fā)生發(fā)展中的各個階段因為腫瘤細胞發(fā)生凋亡、壞死及自噬而釋放到外周血中的一種特殊DNA片段，可由基因組DNA、線粒體DNA和非編碼gDNA等組成[18-19]。與CTCs不同，ctDNA在病人的循環(huán)血中可被大量檢測出來，其檢測豐度為0.01%～93%，是與腫瘤負荷直接相關(guān)的測量值，可間接反映出腫瘤當前狀態(tài)。越來越多的證據(jù)表明，ctDNA在胰腺癌早期診斷上具有重要的作用，其一，與健康受試者相比較，胰腺癌病人循環(huán)血中的ctDNA含量顯著升高[20]。其二，盡管胰腺癌細胞的異質(zhì)性較多樣化，外周血中ctDNA檢測出的胰腺癌特有的基因組學(KRAS突變)和/或表觀遺傳學(DNA甲基化)改變等[21-22]，與胰腺癌組織中的相應(yīng)變化具有較高的一致性[23]。

3.外泌體:外泌體是細胞外膜泡的一種，常呈球狀或柱狀，大小約30～150 nm，密度為1.13～1.19 g/ml，多由正常細胞或腫瘤細胞因胞吐作用而分泌到細胞外或外周血中[24]。其包含大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸(DNA、mRNA、microRNA及l(fā)ong non-coding RNA)等信號分子，是腫瘤細胞之間和/或與腫瘤微環(huán)境之間信號傳導的重要途徑，參與調(diào)控胰腺癌細胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可作為胰腺癌早期診斷的重要探索方向。首先，外泌體主要是活細胞所分泌，其在外周循環(huán)血中出現(xiàn)的時間早于因腫瘤細胞壞死而釋放的ctDNA，理論上可在腫瘤早期階段予以檢測[26]。其次，雖然外泌體的檢測豐度取決于腫瘤的狀態(tài)和所研究的體液，但研究表明，胰腺癌病人循環(huán)血中的外泌體的數(shù)量顯著高于健康受試者。然后，在腫瘤的各個階段都可分泌的外泌體，因其天然的脂質(zhì)雙分子層模型保證了血循環(huán)中的高穩(wěn)定性，且可攜帶大分子量的核酸或蛋白質(zhì)等物質(zhì)，并在其內(nèi)部或表面上具有腫瘤特異性標志物，使其成為胰腺癌液態(tài)活檢較好的檢測內(nèi)容[23]。

4.其他潛在的早期診斷標志物:有報道表明，外周血循環(huán)中的RNA、血小板及免疫細胞等都可能是胰腺癌早期診斷方面潛在的液態(tài)活檢標志物[23]。循環(huán)血RNA的檢測可提供胰腺癌在遺傳學和/或表觀遺傳學等方面改變而導致的基因表達變化信息，較ctDNA檢測更具腫瘤特異性，特別是非編碼RNA檢測，如多項研究已證實，microRNA(miRNA)檢測在區(qū)分胰腺癌病人與健康人或其他胰腺疾病病人方面顯示了非常高的準確性，可作為胰腺癌早期診斷的分子標志物[18,27]。血小板在腫瘤細胞生長、遷移、侵襲及血管生成等方面的重要調(diào)控作用，使其成為了胰腺癌早期診斷方面潛在的標志物，如Best等[28]通過對腫瘤病人血小板RNA進行測序，發(fā)現(xiàn)與55例健康受試者相比，288例腫瘤病人(35例胰腺癌)的診斷準確率可為96%；而對于胰腺癌的診斷，準確率可達100%。同時，也有文獻報道，通過對血小板蛋白質(zhì)組進行檢測，可以區(qū)分早期胰腺癌病人和健康人[29]。免疫細胞，包括巨噬細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞及自然殺傷細胞等，在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，或參與機體免疫應(yīng)答或被腫瘤細胞分泌的外泌體所調(diào)控。檢測這些被調(diào)控后的免疫細胞則為胰腺癌的早期診斷提供了一個可能的契機，如Chen等[30]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)胰腺癌外泌體誘導后的樹突狀細胞在mRNA及l(fā)ncRNA表達上與未誘導的對照組樹突狀細胞存在顯著差異。

二、液態(tài)活檢在胰腺癌早期診斷中的應(yīng)用

1.CTCs與胰腺癌早期診斷：CTCs檢測在20世紀90年代后期由于檢測技術(shù)的進步再次成為了腫瘤領(lǐng)域研究的熱點，并隨之展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用前景。美國食品藥品管理局于2004年首先批準CellSearch系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌CTCs的檢測，現(xiàn)被認為是CTCs檢測研究的金標準[31]。在胰腺癌中，Allard等[32]于2004年，通過CellSearch系統(tǒng)首次在16例確診為胰腺癌病人的循環(huán)血中的6例檢測到CTCs的存在，而并沒有從健康對照組中檢測出CTCs的存在，這表明，CTCs檢測在胰腺癌早期診斷中具有潛在的價值。然而，由于胰腺癌CTCs較其他腫瘤CTCs的特殊性(EMT過程中丟失檢測標志物EpCAM和細胞角蛋白等)，有研究指出，CellSearch系統(tǒng)在胰腺癌診斷中的準確率為11%～48%，甚至在部分晚期胰腺癌病人中的檢出率僅為32.3%[31]。為了進一步提高胰腺癌病人循環(huán)血中CTCs的檢出率，在基于CellSearch系統(tǒng)的基礎(chǔ)上多種新技術(shù)、新方法被運用于CTCs的相關(guān)檢測，如Khoja等[33]運用ISET(isolation by size of epithelial tumor cells method)富集方法檢測病人循環(huán)血中的CTCs，從而避免因CTCs表面標志物EpCAM等丟失導致的檢出率低。與CellSearch系統(tǒng)相比，ISET方法在27例病人(80%為轉(zhuǎn)移病人)中的檢出率可達93%，CellSearch系統(tǒng)的檢出率僅為40%。同時，越來越多的研究表明，采用不同檢測方法的CTCs在Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌病人中的診斷敏感性可>70%，如Zhou等[34]采用免疫磁珠分離富集法檢測胰腺癌病人循環(huán)血中CTCs，對25例病人診斷的靈敏性為96%，特異性為100%，其中，對5例早期胰腺癌病人的診斷率可為100%。Xu等[35]應(yīng)用陰性富集結(jié)合免疫熒光原位雜交技術(shù)(negative enrichment and immunostaining-fluorescence in situ hybridization,NE-iFISH)，發(fā)現(xiàn)6/8的胰腺良性疾病(75%)和8/11的早期胰腺癌(73%)病人中存在CTCs(≥1)；Gao等[36]也采用同樣方法的檢出率可達12/13(92%)。Ankeny等[37]通過微流控法(Microfluidic)對72例胰腺癌和28例胰腺良性疾病病人進行CTCs檢測研究顯示，微流控法的敏感性為75%，特異性為96.4%。Kulemann等[38]進一步通過ScreenCell方法結(jié)合KRAS基因突變檢測對58例胰腺癌病人和10例健康對照人進行CTCs檢測研究，顯示胰腺癌病人CTCs總體檢測率為67%；而Kulemann等[39]采用同樣檢測方法的另一項研究則顯示，早期胰腺癌的檢測率可達80%(8/10)。綜上，雖然上述研究結(jié)果表明CTCs檢測在胰腺癌早期診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景，但由于CTCs富集方法的不同和檢測標志物的多樣性，CTCs在胰腺癌早期診斷中的研究結(jié)果差異較大，仍需大規(guī)模的研究及統(tǒng)一的檢測方法進一步探索其臨床應(yīng)用價值。

2.ctDNA與胰腺癌早期診斷：ctDNA在胰腺癌中的研究始于20世紀80年代，Shapiro等[40]首次在胰腺癌病人外周血中檢測到ctDNA呈高表達狀態(tài)(>100 ng/ml)，而Sorenson等[41]隨后通過PCR法在3例胰腺導管腺癌病人血漿中證實了ctDNA的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌病人血漿中ctDNA的表達水平與健康對照組、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤或慢性胰腺炎病人等不同[26]。隨著腫瘤臨床分期的不同ctDNA的檢出率也不同，如Bettegowda等[42]的研究顯示，在155例胰腺癌病人中ctDNA的檢出率隨著TNM分期的上升而增加。這些研究表明，ctDNA可作為胰腺癌早期診斷的生物分子標志物。同時，近年來的研究顯示，胰腺癌病人外周血中ctDNA的突變檢測較ctDNA豐度檢測的臨床應(yīng)用價值更重要。Zill等[43]對54例胰腺癌病人組織和外周血標本進行突變基因檢測發(fā)現(xiàn)，ctDNA中可檢測到與組織標本90%左右相同的基因突變類型。KRAS作為胰腺癌最重要的驅(qū)動基因之一，其在胰腺癌病人外周血中的突變片段可在近一半病人的血漿DNA中被檢測到，而在健康人中幾乎沒有。因此，ctDNA中的KRAS突變檢測可以作為胰腺癌早期診斷的生物標志物，如Sausen等[44]采用超敏微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)技術(shù)對51例早期胰腺癌病人的ctDNA 中的KRAS 突變進行檢測，結(jié)果顯示,22例病人(43%)血漿ctDNA中具有KRAS基因突變， ctDNA KRAS突變檢出率的診斷特異度大于99.9%。目前，大多數(shù)研究已經(jīng)將胰腺癌ctDNA KRAS基因突變作為識別循環(huán)腫瘤DNA的檢測標志之一。同時，近年來的研究也提示，ctDNA的甲基化檢測也可作為胰腺癌的潛在標志物，如Henriksen等[45]通過對95例胰腺癌、97例慢性胰腺炎、59例急性胰腺炎和27例其它非胰腺癌病人外周血中ctDNA甲基化水平進行檢測，結(jié)果顯示,胰腺癌組ctDNA甲基化基因數(shù)量平均為8.41(95%CI:7.62～9.20)，而對照組為4.74(95%CI:4.40～5.08)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，診斷胰腺癌的靈敏度為76%、特異度為83%。雖然ctDNA為胰腺癌早期診斷提供了一種可能性，但現(xiàn)有研究也提示，在胰腺癌的早期階段，由于ctDNA的釋放量較低或ctDNA的濃度太低被降解，導致KRAS突變檢測對于胰腺癌早期診斷價值似乎有限，如在70%～80%局部進展期和轉(zhuǎn)移性病人中可檢測到ctDNA中的KRAS突變，而對于可切除病人則為30%～68%[31]。同時，由于胰腺癌組織的特殊性，原發(fā)腫瘤中KRAS突變檢測結(jié)果與ctDNA中的KRAS突變檢測結(jié)果的一致性仍不穩(wěn)定，為25%～75%[4,46]。因而，需要更敏感的核酸處理和分析技術(shù)，以及統(tǒng)一的檢測方法和評價標準。

3.外泌體與胰腺癌早期診斷：外泌體因含有豐富的蛋白質(zhì)及核酸等，是胰腺癌早期診斷方面潛在的重要液態(tài)活檢標志物，如Melo等[47]于2015年通過對146例胰腺癌病人、32例胰腺良性疾病及120例健康對照人的循環(huán)血外泌體表面標志物進行檢測分析發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(glypican-1,GPC1)蛋白的表達顯著升高，對胰腺癌的診斷具有100%的敏感性和特異性，可以早期分辨胰腺癌病人、正常人及胰腺良性疾病病人；Hu等[48]的研究證實，外泌體內(nèi)GPC1 mRNA的表達對于胰腺癌早期診斷具有重要的意義，可顯著區(qū)分早期病人和晚期病人，是胰腺癌早期診斷的潛在標志物。然而，后續(xù)的相關(guān)研究指出，GPC1缺乏可靠的早期診斷能力，如Castillo等[49]報道GPC1在正常胰腺組織和胰腺癌細胞系中都有表達，因此缺乏診斷的價值；Lai等[50]對29例胰腺癌和11例慢性胰腺炎病人的循環(huán)血外泌體中的GPC1表達進行檢測發(fā)現(xiàn)，GPC1不能有效區(qū)分胰腺癌和慢性胰腺炎。同時，相關(guān)研究亦指出GPC1聯(lián)合其他外泌體分子標志物的檢測可提高診斷效能，如Yang等[51]報道，GPC1聯(lián)合EGFR、EpCAM、MUC1及WNT2等的診斷靈敏度和特異度可為86%和81%；Lewis等[52]發(fā)現(xiàn)，GPC1聯(lián)合CD63檢測的診斷靈敏度為99%，特異度82%。究其原因，可能是由于研究方法、檢測對象或?qū)嶒炘噭┑牟町悓е碌?。因此，仍需要進一步的深入研究GPC1在胰腺癌早期診斷方面的臨床應(yīng)用。此外，有研究報道鋅指蛋白4(zinc finger protein-4,ZIP4) 亦是胰腺癌早期診斷潛在的標志物之一[53]。

近來年的研究表明，循環(huán)血中外泌體內(nèi)miRNA在胰腺癌早期診斷方面具有重要的意義，如Que等[54]于2013年對16例胰腺癌、6例慢性胰腺炎、5例胰腺囊性疾病、5例壺腹癌及6例健康對照組人循環(huán)血外泌體內(nèi)miRNA進行檢測分析發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p、miR-21及miR-155等呈差異性表達；Goto等[55]的研究發(fā)現(xiàn)，32例胰腺癌循環(huán)血中外泌體內(nèi)miR-21、miR-191及miR-451a等較29例胰腺導管內(nèi)乳頭狀黏液腫瘤病人(intraductal papillary mucinous neoplasm,IPMN)和22例健康對照組人表達升高，提示外泌體內(nèi)異常表達的miRNA是胰腺癌早期診斷的潛在標志物之一。然后，Madhavan等[56]通過對131例胰腺癌病人和64健康對照組人循環(huán)血中外泌體內(nèi)miRNA進行芯片檢測分析發(fā)現(xiàn)，miR-1246、miR-4644、miR-3976和miR-4306等表達顯著升高，聯(lián)合這4種miRNA的檢測，可顯著提高胰腺癌的診斷效能，但存在9%的假陽性和20%的假陰性可能。Xu等[57]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌循環(huán)血中外泌體內(nèi)表達升高的miR-196a、miR-196b及miR-1246等，在胰腺癌診斷效能評價中的ROC曲線下面積(AUCs)分別為0.81、0.71和0.73。Lai等[50]對29例胰腺癌和11例慢性胰腺炎病人循環(huán)血中外泌體內(nèi)的檢測發(fā)現(xiàn)，表達異常的miR-10b、 miR-21、miR-30c、miR-181a及l(fā)et-7a對胰腺癌診斷的靈敏性及特異性均為100%。綜上，以上結(jié)果表明,外泌體內(nèi)miRNA可以作為胰腺癌早期診斷和鑒別診斷的生物標志物，但存在研究方法不統(tǒng)一、實驗結(jié)果重復性較差及檢測樣本例數(shù)較小等問題，仍需進一步的深入探索。

少數(shù)研究也探索了循環(huán)血外泌體內(nèi)DNA(exosomal DNA,exoDNA)在胰腺癌早期診斷中的應(yīng)用，如Allenson等[58]通過ddPCR系統(tǒng)在樣本總量為127例可切除的、局部進展期及轉(zhuǎn)移性胰腺癌循環(huán)血外泌體內(nèi)可檢測到KRAS基因突變，其檢測率分別為67%、80%和85%，高于外周循環(huán)血中的ctDNA KRAS基因突變檢測率(分別為46%、31%和58%)；在另一項研究中，Yang等[59]應(yīng)用ddPCR系統(tǒng)在48例胰腺癌、9例慢性胰腺炎及7例胰腺導管內(nèi)乳頭狀黏液瘤病人循環(huán)血外泌體內(nèi)檢測到KRAS和TP53基因的突變率分別為40%和4%、55.6%和0、28.6%和14.3%。因此，以上結(jié)果提示了exoDNA可能是胰腺癌早期診斷的潛在標志物，然而現(xiàn)有研究表明其在診斷中的作用尚需進一步探索。其一，在健康對照人循環(huán)血外泌體內(nèi)可檢測到KRAS突變，突變率可高達3.5%，可出現(xiàn)假陽性結(jié)果[60]；其二，目前的研究報道exoDNA在胰腺癌中的診斷效能較差，Allenson等[58]研究報道exoDNA KRAS突變率的診斷靈敏度和特異度分別為64%和85%，Yang等[59]指出exoDNA KRAS突變率的靈敏度和特異度則分別為40%和97%，總體的診斷準確率僅為35%～69%。

液態(tài)活檢與傳統(tǒng)組織活檢相比，具有操作簡單、不良反應(yīng)少及經(jīng)濟成本低等特點，不僅減輕了病人的痛苦，且臨床應(yīng)用更為簡便。雖然CTCs、ctDNA以及外泌體等檢測在胰腺癌早期診斷中的價值較高，但目前尚不足以替代傳統(tǒng)檢測方法，仍需發(fā)展新的檢測技術(shù)和大規(guī)模的臨床研究驗證。隨著液態(tài)活檢技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，該技術(shù)在胰腺癌早期診斷中的應(yīng)用具有廣闊的前景。