北京市門(mén)頭溝區(qū)2018-2020年急性胃腸炎患者諾如病毒基因型分析

劉海濤，曹殿起，張博文，呂秋艷，蘇 健

(門(mén)頭溝疾病預(yù)防控制中心，北京 102300)

急性胃腸炎是全球范圍內(nèi)的常見(jiàn)病，臨床主要表現(xiàn)為大便次數(shù)增多且性狀改變，可伴有發(fā)熱、嘔吐、腹痛，重者繼發(fā)水電解質(zhì)紊亂、酸堿失衡和全身中毒癥狀。在我國(guó)，每年患急性胃腸炎人數(shù)約8.36億，急性胃腸炎發(fā)病率位居所有傳染性疾病首位；在世界范圍內(nèi)，病毒是造成急性腹瀉發(fā)生的主要原因，其中，諾如病毒( Norovirus, NoV)已成為最常見(jiàn)的腸道感染病原體之一，繼輪狀病毒(Rotavirus, RV) 之后，NoV已成為可引起人類(lèi)病毒性急性胃腸炎的主要病原體[1]。在全球，每年因諾如病毒感染導(dǎo)致約6.99億人感染和超過(guò)20萬(wàn)人死亡[2-3]。

自2014年冬季以來(lái)，我國(guó)諾如病毒暴發(fā)疫情大幅增加。為了解北京市門(mén)頭溝區(qū)急性胃腸炎患者諾如病毒流行特征，探討溯源關(guān)系，現(xiàn)對(duì)2018-2021年急性胃腸炎患者諾如病毒基因特征進(jìn)行分析，為諾如病毒感染的科學(xué)防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑 Q5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Theme公司)，kingfisher核酸提取儀(美國(guó)Theme公司)。諾如病毒GI群檢測(cè)試劑盒、諾如病毒GⅡ群檢測(cè)試劑盒(北京卓誠(chéng)惠生有限公司)，核酸提取試劑盒(上海醫(yī)脈賽科技有限公司)。

1.2樣本來(lái)源 收集2018年1月-2020年12月北京市門(mén)頭溝區(qū)監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院(門(mén)頭溝區(qū)區(qū)醫(yī)院、京煤集團(tuán)總醫(yī)院)的急性胃腸炎患者糞便標(biāo)本。采集標(biāo)準(zhǔn): 急性胃腸炎病例定義是24小時(shí)內(nèi)嘔吐1次，或者腹瀉達(dá)到3次。急性胃腸炎糞便標(biāo)本放于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3病毒核酸提取 制備10%的便懸液，取黃豆大小的糞便，用300 μl的PBS稀釋?zhuān)袷幓靹蚝? 500 r/min，離心10 min；離心結(jié)束取250 μl上清液，混勻后3 000 r/min，離心5 min，取上清140 μl置于無(wú)菌1.5 ml EP管備用，使用核酸提取儀，參考試劑盒說(shuō)明書(shū)操作流程步驟處理離心好的上清糞便樣本，最后將提取完成的RNA溶液靜置、備用。

1.4基因群鑒定 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)樣本基因群進(jìn)行鑒定，試劑盒選用諾如病毒GI群檢測(cè)試劑盒、諾如病毒GⅡ群檢測(cè)試劑盒。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系，使用Q5型實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5基因型檢測(cè) 使用QiagenOne-Step RT-PCR kit試劑盒對(duì)基因群鑒定為諾如病毒GⅡ的陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行基因型檢測(cè)。引物擴(kuò)增ORF1和ORF2的重疊區(qū)，GⅡ引物為 MON 431(+)5’-TGG ACI AGR GGⅠ CCY AAY CA-3’和 G2SKR(-)5’-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT-3’。配置20 μl反應(yīng)體系: 5×RT-PCRBuffer 5 μl，dNTP mix 1 μl，RT-PCR Enzymemix 1μl，Rnase Inhibitor 11 μl，上下游引物各0.5μl，模板5 μl；PCR儀反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?2 ℃ 30 min; 95 ℃ 15 min; 95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán); 72 ℃ 10 min。陽(yáng)性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。使用諾如病毒暴發(fā)監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)中數(shù)據(jù)庫(kù)BioNumer7.6對(duì)序列進(jìn)行基因型比對(duì)。應(yīng)用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯，根據(jù)文獻(xiàn)檢索，從GenBank中下載國(guó)內(nèi)、外諾如病毒相關(guān)序列片段，應(yīng)用lCusatl W軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和分析，MEGA7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1諾如病毒基因群檢測(cè)結(jié)果 2018-2020年收集糞便標(biāo)本共計(jì)679份，陽(yáng)性率為10.75%(73/679)；2018年諾如病毒陽(yáng)性檢出率是6.77%(9/133)。2019年諾如病毒陽(yáng)性檢出率是為13.42%(20/149)。2020年諾如病毒陽(yáng)性檢出率為11.08%(44/397)。檢出的諾如病毒以GⅡ基因群為主(95.89%，70/73)，GI基因群為4.11% (3/73)。2018年、2019年、2020年諾如病毒陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.354，P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2諾如病毒GⅡ基因型分析 70份GⅡ基因群樣本測(cè)序成功57份，使用諾如病毒暴發(fā)監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)BioNumer7.6對(duì)57份樣本的聚合酶區(qū)和衣殼區(qū)序列同時(shí)分析，其中，8份樣本(GⅡ.17[P17]14.04%，8/57)聚合酶和衣殼區(qū)分型結(jié)果一致，其余樣本在聚合酶區(qū)和衣殼區(qū)分型結(jié)果均不一致，為重組毒株。重組基因型分別是GⅡ.6 [P7](12.28%，7/57)，GⅡ.4[P16](6.90%，4/58)，GⅡ.3[P12](7.02%，6/57)，GⅡ.2[P16](56.14%，32 /57)，見(jiàn)圖1。

2.3諾如病毒GⅡ基因型系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 選擇GenBank中的參考序列(成都MW386187.1，北京MW205667.1，北京MW205630.1，泉州MK671484.1，北京MW205658.1，印度MW362535.1，臺(tái)州MH842230.1，美國(guó)MT344182.1)，與57份樣本測(cè)序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如下：GⅡ.17[P17]出現(xiàn)在2018和2019年，與臺(tái)州株(2017 MH842230.1)較為接近，變異不明顯，核苷酸相似度為98.8%～100%，而與美國(guó)株(2020，MT344182.1)距離較遠(yuǎn)。GⅡ.2[P16]在2018、2019和2020年均有出現(xiàn)，核苷酸相似度為86%～99%，與泉州株(2017 MK671484.1)較為接近，但與北京(2020，MW205658.1)、印度(2020，MW362535.1)距離較遠(yuǎn)，相似度均為86%。GⅡ.6 [P7]主要出現(xiàn)在2020年，與成都株(2020，MW386187.1)高度同源，核苷酸相似度為100%。GⅡ.4[P16]和GⅡ.3[P12]全部出現(xiàn)在2020年，與北京株(2020，MW205667.1；2020，MW205630.1)高度同源，核苷酸相似度均為100%，見(jiàn)圖2。

3 討 論

急性胃腸炎臨床表現(xiàn)主要特征為突發(fā)劇烈嘔吐(更常見(jiàn)于兒童)、非血性腹瀉(在成人中更常見(jiàn))惡心及腹痛。潛伏期為12～48 h，在健康人群中，癥狀的持續(xù)時(shí)間通常不超過(guò)48 h，同時(shí)多數(shù)患者感染呈現(xiàn)自限性，3 d后消失；此病毒可感染所有年齡段人群，諾如病毒可造成全球近1/5的急性腸胃炎病例發(fā)生。

引起急性胃腸炎主要的病原體是諾如病毒，諾如病毒屬于人類(lèi)杯狀病毒科諾如病毒屬，是無(wú)包膜的單股正鏈RNA病毒?；蚪M全長(zhǎng)約7.5 kb，含有3個(gè)開(kāi)放讀碼框架(three open reading frames, ORFs)，ORF1、ORF2、ORF3。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2和ORF3編碼衣殼蛋白(VP1)和次要衣殼蛋白(VP2)。根據(jù)衣殼蛋白VP1氨基酸序列的差異，諾如病毒至少可分為10個(gè)不同的基因群(GⅠ-GⅩ)，其中，GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅧ和 GⅨ(以前稱(chēng)為GⅡ.15)可以感染人類(lèi)[4-5]，GI與GⅡ是導(dǎo)致人類(lèi)急性胃腸炎發(fā)生的主要基因群，近幾年，引起急性胃腸炎又以GⅡ基因群為主，GⅡ基因群是全球范圍內(nèi)諾如病毒最流行的基因群。根據(jù)病毒RdRp和VP1區(qū)的核苷酸序列差異，每個(gè)基因群又可進(jìn)一步分為不同的基因型。作為RNA病毒，諾如病毒極易在ORF1和ORF2交接處發(fā)生變異和重組，重組型諾如病毒的多聚酶區(qū)和衣殼蛋白VP1區(qū)多屬于不同基因型。ORF1-ORF2連接區(qū)的重組現(xiàn)象發(fā)生頻繁，新重組型別的出現(xiàn)增加了諾如病毒的遺傳多樣性，侵襲性更穩(wěn)定，能夠逃避群體免疫的侵襲，具備了更好的人群適應(yīng)性和傳播能力。

本研究結(jié)果顯示，北京市門(mén)頭溝區(qū)急性胃腸炎諾如病毒陽(yáng)性檢出率是10.75%，與天津市成人急性胃腸炎人群11.77%的陽(yáng)性檢出率[6]，上海市10.87%的陽(yáng)性檢出率基本持平[9]，但低于天津市兒童急性胃腸炎人群26.0%的陽(yáng)性檢出率[7]，高于黑龍江省7.14%的陽(yáng)性檢出率[8]，提示急性胃腸炎諾如病毒陽(yáng)性檢出率可能與年齡結(jié)構(gòu)，地域特征均有關(guān)聯(lián)。

本研究結(jié)果顯示，北京市門(mén)頭溝區(qū)諾如病毒主要以GⅡ基因群為主，諾如病毒GⅡ基因群占95.89%，GI基因群占4.11%。對(duì)57份諾如病毒GⅡ基因群樣本的聚合酶區(qū)、衣殼區(qū)基因序列擴(kuò)增和序列測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，只有8份樣本聚合酶和衣殼區(qū)分型結(jié)果一致，為GⅡ.17[P17]，其余樣本聚合酶區(qū)和衣殼區(qū)分型結(jié)果均不一致，說(shuō)明諾如病毒GⅡ基因群以重組基因型為主。在重組基因型中，分別有GⅡ.6 [P7]，GⅡ.4[P16]，GⅡ.3[P12]，GⅡ.2[P16]4種重組基因型。其中，GⅡ.2[P16] 在2018、2019和2020年均有出現(xiàn)，占全部檢出諾如病毒基因型的56.14%，提示該重組基因型在北京市門(mén)頭溝區(qū)出現(xiàn)流行。自2016年開(kāi)始，國(guó)內(nèi)廣東、香港、北京等地以及德國(guó)、法國(guó)相繼出現(xiàn)的GⅡ.2[P16]重組株引起的諾如病毒感染疫情大幅增加[10-11]，與此同時(shí)，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，2016年以來(lái)出現(xiàn)的GⅡ.2[P16]重組株區(qū)別于2016年以前的GⅡ.2[P16]，形成了一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化分支，提示北京市門(mén)頭溝區(qū)流行的基因型別是進(jìn)化的獨(dú)立分支。門(mén)頭溝區(qū)GⅡ.2[P16]基因型研究結(jié)果表明，核苷酸相似度為86%～99%，與泉州株(MK671484.1)2017年度的基因型較為接近，但與北京(MW205658.1)、印度(MW362535.1)2020年基因型距離較遠(yuǎn)，相似度僅為86%，提示基因型別可能發(fā)生了突變，有待進(jìn)一步研究。

自2012年，GⅡ.4一直是導(dǎo)致全球范圍內(nèi)急性胃腸炎疫情暴發(fā)的主要基因型，在我國(guó)廣州，北京，上海等國(guó)內(nèi)多個(gè)城市也發(fā)現(xiàn)此基因型的流行；在美國(guó)，GⅡ.4基因型導(dǎo)致了急性胃腸炎疫情多次暴發(fā)。GⅡ.4的流行趨勢(shì)一直持續(xù)到2014年底，隨后GⅡ.17基因型取代了GⅡ.4基因型，成為暴發(fā)疫情中的優(yōu)勢(shì)基因型；在散發(fā)病例中，諾如病毒的流行趨勢(shì)一直表現(xiàn)為基因型多樣性[12]。GⅡ.3，同樣是導(dǎo)致諾如病毒感染急性胃腸炎的重要原因，GⅡ.3基因型的感染多發(fā)生于12歲以下的兒童，顯示該基因型對(duì)兒童可能有明顯的傾向。本研究同樣顯示：GⅡ.6 [P7]、 GⅡ.4[P16]和GⅡ.3[P12]基因型均在2020年度檢出，且與成都株(2020，MW386187.1)、北京株(2020，MW205667.1；2020，MW205630.1)均高度同源，核苷酸相似度均為100%，提示本區(qū)諾如病毒的基因型呈現(xiàn)多基因型并存的趨勢(shì)。

綜上所述，自2018年以來(lái)，GⅡ.2[P16]型諾如病毒持續(xù)在本地區(qū)流行，但諾如病毒GⅡ.6 [P7]基因型，GⅡ.4[P16]基因型，GⅡ.3[P12]基因型的出現(xiàn)，提示病毒基因型構(gòu)成復(fù)雜。諾如病毒株的基因分型具有重要意義，其突變和重組現(xiàn)象可以決定諾如病毒在易感人群中的廣泛傳播和持續(xù)存在[13]。病毒進(jìn)化可由選擇性壓力引起的突變和重組所介導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致病毒流行種群不斷變化，因此對(duì)諾如病毒的分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)[14]，特別是監(jiān)測(cè)諾如病毒的基因型和重組基因型的動(dòng)態(tài)流行特征，以評(píng)估諾如病毒對(duì)公共衛(wèi)生事業(yè)的影響，從而為諾如病毒的預(yù)防控制和預(yù)測(cè)預(yù)警提供科學(xué)的理論依據(jù)。