單胚胎移植策略中胚胎發(fā)育潛能的評(píng)估方法

劉 芳， 于辛酉， 包俊華， 金 銳， 唐大偉， 白 剛

（1.銀川市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，銀川 750001； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，銀川 750004）

目前全世界有700 多萬(wàn)兒童是通過(guò)輔助生殖技術(shù)出生的。輔助生殖的最終目的是在保護(hù)母體安全的同時(shí)獲得足月健康的嬰兒。多胎妊娠有較高的早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)和更高的并發(fā)癥發(fā)生率，這是在輔助生殖技術(shù)應(yīng)用中一直存在的一個(gè)主要障礙。提高妊娠率的同時(shí)降低多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)，是當(dāng)前輔助生殖需要重點(diǎn)攻克的方向。單胚胎移植在保證妊娠率的同時(shí)，可降低多胎妊娠、早產(chǎn)、低出生體質(zhì)量以及剖宮產(chǎn)的發(fā)生率。評(píng)估胚胎發(fā)育的質(zhì)量和潛能是提高臨床妊娠率的關(guān)鍵步驟之一，是從實(shí)驗(yàn)室走向臨床的首要指標(biāo)，也是預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的有力證據(jù)。因此，避免多胚胎移植并選擇高質(zhì)量的單胚胎進(jìn)行移植，在近些年也得到更廣泛的認(rèn)可和發(fā)展。

選擇移植最有發(fā)育潛能的胚胎在輔助生殖過(guò)程中是非常重要的，而如何能夠安全無(wú)創(chuàng)、快捷有效地選擇出最適合的胚胎，已成為當(dāng)前胚胎移植研究的熱點(diǎn)。目前臨床上已經(jīng)有許多質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，包括傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和近幾年發(fā)展的代謝組學(xué)、延時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)和基因組學(xué)等評(píng)價(jià)方法，現(xiàn)對(duì)近期各種研究結(jié)果綜述如下。

1 代謝組學(xué)方法

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的一門學(xué)科，它很好地反映了基因表達(dá)下游的事件，并提供了有關(guān)細(xì)胞內(nèi)代謝有價(jià)值的信息，這是其他組學(xué)技術(shù)無(wú)法做到的。它能反映機(jī)體的動(dòng)態(tài)代謝狀態(tài)，因此可以檢測(cè)疾病與藥物作用的相關(guān)性。代謝組學(xué)大概能測(cè)定3000 種代謝物，數(shù)據(jù)量遠(yuǎn)小于蛋白組和轉(zhuǎn)錄組，相對(duì)而言分析可以更快[1]。目前常用的分析技術(shù)包括核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、拉曼光譜（Raman）、近紅外光譜（near infrared，NIR）、質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）、色譜（chromatography）和色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[2-3]，它們?cè)跍y(cè)定不同代謝物上各有優(yōu)勢(shì)。由于代謝物種類繁多，各物質(zhì)之間差異比較大，且濃度分布范圍廣，僅靠一種分析技術(shù)無(wú)法完成。目前已知總體質(zhì)量差的胚胎移植與單胎出生體質(zhì)量的降低有關(guān)，而評(píng)估胚胎總體質(zhì)量需要全面測(cè)定胚胎的各種代謝物[4]。因此，臨床上常聯(lián)合使用幾種分析技術(shù)對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行全面分析[5]。預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能相關(guān)，且研究較多的代謝產(chǎn)物，主要源于以下幾個(gè)微環(huán)境。

1.1 卵泡液

卵泡液是指發(fā)育中卵母細(xì)胞的體內(nèi)微環(huán)境，包含對(duì)卵泡生長(zhǎng)和卵母細(xì)胞成熟至關(guān)重要的所有成分以及卵母細(xì)胞排出的代謝物。卵泡液的代謝組成一定程度上反映了卵母細(xì)胞的質(zhì)量[6]。Pi?ero-Sagredo 等[7]首次利用 NMR 研究人體卵泡液，鑒定出一些能作為卵泡成熟狀態(tài)的生物標(biāo)記物的代謝物，選擇出具有更高受精潛能的卵母細(xì)胞，提高體外受精（in vitro fertilization，IVF）的成功率。McRae 等[8]利用NMR 技術(shù)對(duì)10 名接受自然周期IVF 女性中的卵泡液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)排卵期的卵泡液為高水平的乳酸、丙酮酸和低水平的葡萄糖。有研究[9]通過(guò)氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）的代謝組學(xué)方法，比較IVF 成功和IVF 重復(fù)失?。≧IF）患者卵泡液的代謝物，發(fā)現(xiàn)RIF 卵泡液組幾種氨基酸（纈氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、脯氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、蛋氨酸和鳥氨酸）水平升高，二羧酸、膽固醇和一些有機(jī)酸水平降低。但卵泡液作為輔助生殖的生物標(biāo)記物，目前仍有明顯的局限性。比如，卵巢刺激過(guò)程或沖洗介質(zhì)都可以改變卵泡液的成分[10]。由此可見(jiàn)，關(guān)于卵泡液的代謝組學(xué)分析的研究還處于起步階段，要實(shí)現(xiàn)卵泡液的整體代謝組學(xué)圖譜的臨床應(yīng)用還需要更多的研究。

1.2 胚胎培養(yǎng)基

如今在臨床實(shí)踐中，快速經(jīng)濟(jì)的胚胎質(zhì)量評(píng)估方法仍是形態(tài)學(xué)評(píng)估和卵裂率。胚胎質(zhì)量的生物標(biāo)記可以克服形態(tài)學(xué)評(píng)估的一些弱點(diǎn)。胚胎培養(yǎng)基（embryo culture medium，ECM）的研究表明，胚胎之間的代謝差異可能表明了受精成功的潛力，但其在臨床應(yīng)用方面的意義仍有待商榷[11]。Vergouw 等[12]使用近紅外光譜（NIR）對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行代謝組學(xué)分析，選擇第3 天的胚胎，與僅通過(guò)形態(tài)學(xué)選擇胚胎相比，試管嬰兒的活產(chǎn)率無(wú)差異。Hardarson 等[13]的研究表明，在胚胎形態(tài)中加入ECM 的近紅外光譜并不能提高單胚胎移植（SET）后第2 天和第 5 天的妊娠率。Sfontouris等[14]研究發(fā)現(xiàn)基于NIR 儀器進(jìn)行的ECM 代謝組學(xué)分析對(duì)第2、3 和5 天的妊娠率和活產(chǎn)率均無(wú)有利影響。以上研究表明，與僅使用形態(tài)學(xué)相比，將ECM 代謝組學(xué)分析加入形態(tài)學(xué)并不能提高獲得可行妊娠的概率。

1.3 子宮內(nèi)膜

人類子宮內(nèi)膜是一個(gè)動(dòng)態(tài)組織，在自然月經(jīng)周期的短時(shí)間內(nèi)接受著床，稱為“著床窗口”。這個(gè)窗口隨著月經(jīng)周期的長(zhǎng)短而變化，與正常周期19～21 d 一致。在同一周期內(nèi)抽吸子宮內(nèi)膜液可以不影響著床或妊娠率，這意味著子宮內(nèi)膜的代謝組學(xué)分析可以與胚胎移植在同一周期內(nèi)進(jìn)行[15-16]。識(shí)別與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的生物標(biāo)記物在臨床上是可取的，可影響輔助生殖治療患者的妊娠率。

2 延時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)

延時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)是一種對(duì)輔助生殖過(guò)程中胚胎形態(tài)和發(fā)育動(dòng)力學(xué)進(jìn)行半定量評(píng)價(jià)的新技術(shù)，是否具有臨床應(yīng)用價(jià)值尚無(wú)定論[17-18]。傳統(tǒng)上，胚胎評(píng)估是指將胚胎從常規(guī)培養(yǎng)箱中取出，每天在光鏡下鏡檢來(lái)進(jìn)行評(píng)估。延時(shí)系統(tǒng)是指頻繁地拍攝胚胎的數(shù)字圖像，將延時(shí)記錄技術(shù)與臨床實(shí)踐相結(jié)合，使胚胎學(xué)家在不干擾胚胎培養(yǎng)的同時(shí)，對(duì)胚胎發(fā)育有更深入的了解。使用帶有形態(tài)動(dòng)力學(xué)算法的延時(shí)攝影系統(tǒng)可以顯著改善妊娠和活產(chǎn)率，并減少早期妊娠損失[19]。Rubio 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在綜合胚胎鏡延時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中培養(yǎng)和選擇胚胎的方法改善了生殖結(jié)果。延時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)組的持續(xù)妊娠率增加至51.4%，標(biāo)準(zhǔn)組的持續(xù)妊娠率為41.7%。Adamson 等[21]對(duì)基于 TLM 系統(tǒng)的第 3 天胚胎移植研究發(fā)現(xiàn)，與僅基于形態(tài)學(xué)分析比較，試驗(yàn)組的胚胎移植率和臨床妊娠率高于對(duì)照組。除了鑒定具有高植入潛能的胚胎外，延時(shí)分析還揭示了常規(guī)靜態(tài)形態(tài)學(xué)評(píng)估所遺漏的異常事件。多核、直接卵裂（1～3 個(gè)細(xì)胞直接分裂）和反向卵裂等特異事件均被發(fā)現(xiàn)與植入電位降低有關(guān)[22-25]。而在 Goodman 等[18]的研究中，添加延時(shí)形態(tài)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)并未改善臨床生殖結(jié)果，臨床妊娠率和著床率總體上與囊胚轉(zhuǎn)移相似。因此，延時(shí)診斷系統(tǒng)提供了有關(guān)胚胎質(zhì)量的寶貴信息，可幫助臨床醫(yī)生選擇胚胎進(jìn)行單胚胎移植。延時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)中，標(biāo)準(zhǔn)化的觀測(cè)時(shí)間還沒(méi)有一個(gè)確切點(diǎn)，但這一點(diǎn)在臨床上是至關(guān)重要的。因此也需要更多的科研數(shù)據(jù)進(jìn)一步確定這一觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)，以方便延時(shí)檢測(cè)技術(shù)在臨床上更廣泛地使用。

3 胚胎植入前遺傳篩查

遺傳信息的載體——染色體是影響胚胎發(fā)育潛能的重要因素，年齡超過(guò)40 歲的女性的染色體異常率≥50%。染色體異常對(duì)胚胎發(fā)育或胎兒發(fā)育有致死效應(yīng)，因此在輔助生殖過(guò)程中，染色體篩查可提高染色體異?；颊叩呐R床妊娠率和降低自然流產(chǎn)率，尤其適用于高齡產(chǎn)婦。目前染色體篩查的主要方法是植入前非整倍體遺傳檢測(cè)（PGT-A），也稱為 PGS[26]。PGS 通過(guò)分析全部24 條染色體的拷貝數(shù)，以篩查胚胎非整倍性改變。Forman 等[27]納入了 175 名年齡≤42 歲的體外受精夫婦，一組接受單整倍體胚胎移植，另一組接受未活檢的雙胚胎移植。結(jié)果顯示，前者的多胞胎接生率遠(yuǎn)低于后者。通過(guò)對(duì)35 歲及以上的婦女使用 PGS，多胎妊娠率明顯降低[28]。Kang 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在年齡≤37 歲的女性中，IVF-PGS 對(duì)活產(chǎn)率和流產(chǎn)率無(wú)影響；但在年齡＞37 歲的女性中，IVFPGS 確實(shí)改善了臨床妊娠率和活產(chǎn)率。但另有研究[26]顯示，PGS 第3 天活檢對(duì)胚胎有侵襲性，可能會(huì)導(dǎo)致胚胎嵌合，而這種胚胎嵌合現(xiàn)象會(huì)嚴(yán)重干擾PGS 的結(jié)果解讀。新一代測(cè)序（NGS）正在取代最初PGS 中的熒光原位雜交技術(shù)（FISH），減少對(duì)胚胎的侵襲性，且具有精度高、成本低的優(yōu)點(diǎn)，但仍會(huì)導(dǎo)致胚胎嵌合。因此，PGS 作為體外受精患者篩選技術(shù)的價(jià)值還有待確定[30]。

越來(lái)越多的輔助生殖接受者在臨床咨詢后，患者對(duì)懷孕可能性的重視程度降低，而對(duì)孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)期風(fēng)險(xiǎn)的重視程度增高。在咨詢之后，大量的接受者會(huì)選擇單胚胎移植[31]。對(duì)胚胎質(zhì)量進(jìn)行科學(xué)的評(píng)估是保證妊娠率的一個(gè)重要方法。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和近幾年發(fā)展的代謝組學(xué)、延時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)和基因組學(xué)等評(píng)價(jià)方法，在臨床應(yīng)用上各有優(yōu)勢(shì)。這可能與胚胎的發(fā)育潛能受多種因素影響、不同年齡的婦女卵母細(xì)胞質(zhì)量不同等有關(guān)，最終導(dǎo)致各種檢測(cè)方法得到的結(jié)論不一致。故單一的形態(tài)學(xué)指標(biāo)不足以預(yù)測(cè)胚胎的最終結(jié)局，需要從更多維度和更多水平來(lái)綜合評(píng)價(jià)。因此，在保證無(wú)創(chuàng)準(zhǔn)確、高效快速的基礎(chǔ)上，合理利用篩選方法十分重要。此外，還需要更多的臨床研究結(jié)果，讓患者、醫(yī)生和衛(wèi)生保健工作人員相信，即使單胚胎移植可能稍微延長(zhǎng)了受孕的時(shí)間，選擇性單胚胎移植對(duì)母體和胎兒總體影響要優(yōu)于多胚胎移植。