短串聯(lián)重復(fù)序列分型檢測應(yīng)用的研究進(jìn)展

李 娟，慕 力，李旭婧，史 麗，簡小聰

（協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司 天津 300384）

短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）是指重復(fù)單位長度為2～6 bp的重復(fù)序列，也稱為微衛(wèi)星序列，包括位于中間的核心序列和位于外圍的側(cè)翼區(qū)，其高度的多態(tài)性源于核心序列的重復(fù)次數(shù)的不同，具有個體特征，在人類全基因組均勻的分布。作為一個重要的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，STR基因座還具有以下特點：（1）重復(fù)序列串聯(lián)排列，多態(tài)性好；（2）產(chǎn)物片段在500 bp以下，對DNA質(zhì)量要求低，易于擴(kuò)增；（3）靈敏度高；（4）擴(kuò)增片段相近，擴(kuò)增條件相似，可進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增；（5）位點信息明確，可實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和自動化。STR被稱作第二代DNA指紋技術(shù)，并已廣泛用于法醫(yī)DNA分析、遺傳制圖、連鎖分析、親權(quán)鑒定、細(xì)胞株鑒定、個體識別、疾病基因定位、移植后嵌合和物種多態(tài)性研究等領(lǐng)域[1]。

熒光標(biāo)記多重擴(kuò)增結(jié)合毛細(xì)管電泳（CE）的分型檢測技術(shù)是目前STR分型最主要的手段，其分型策略是長度多態(tài)性檢測，根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端序列的保守性，設(shè)計一對特異引物，利用PCR技術(shù)，將STR基因座擴(kuò)增出來，得到的PCR產(chǎn)物帶有熒光信號在毛細(xì)管電泳過程中可以被探測并識別。采集到的熒光信號經(jīng)過分析比對，轉(zhuǎn)換為基因型數(shù)據(jù)，最終推算出STR重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)，從而獲得位基因分型。

1.STR在親權(quán)鑒定中的應(yīng)用

STR片段分析具有以下特性：（1）除同卵雙生外，每個人包含的DNA序列是獨一無二的；（2）同一個個體的各種組織DNA具有相同的序列特征；（3）同一個個體的DNA序列在一生當(dāng)中保持不變（除某些疾病外）；（4）同一個個體的DNA一半來自母親，一半來自父親。以ABI公司出品的GlobalFiler親子鑒定試劑盒舉例，該試劑盒能檢測23個位點，其隨機(jī)匹配概率高達(dá)7×10-27。在伍新堯等[2]研究的親權(quán)判斷標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于親子鑒定的結(jié)果判讀為三聯(lián)體親權(quán)鑒定至少要檢測15個STR基因座，出現(xiàn)1個矛盾基因座，就需要增加至19個基因座；出現(xiàn)2個矛盾基因座，就需要增加至28個基因座；出現(xiàn)3個矛盾基因座，就需要增加至35個或以上基因座，若未再出現(xiàn)新的矛盾基因座，通過矛盾基因座的父權(quán)指數(shù)來計算出累積父權(quán)指數(shù)（CPI），若達(dá)到或超過10 000（父權(quán)概率為0.9 999），可以做出“肯定親生關(guān)系”的結(jié)論。若出現(xiàn)4個矛盾基因座，則直接做出“非親生關(guān)系”結(jié)論。單親親子鑒定至少要檢測18個STR基因座，若發(fā)現(xiàn)1個矛盾基因座，就需要增加至29個或以上基因座；若發(fā)現(xiàn)2個矛盾基因座，則需要增加至41個或以上基因座。將矛盾基因座的父權(quán)指數(shù)計算CPI，若達(dá)到或超過10 000，可以做出“不排除親生關(guān)系”或“支持存在親生關(guān)系”的結(jié)論。若發(fā)現(xiàn)3個矛盾基因座，則直接作出否定“親生關(guān)系”的結(jié)論。

2.STR在細(xì)胞株的鑒定中的應(yīng)用

應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的細(xì)胞被錯誤鑒定和交叉污染的問題，稱為科研界迫切需要解決的質(zhì)量控制問題。德國細(xì)胞庫對人類細(xì)胞系原始庫調(diào)查交叉污染時做的252株新建系細(xì)胞有18%的細(xì)胞系存在交叉污染，伊朗的細(xì)胞庫中也有近18.8%的污染率[3]，而階段性的鑒定也是必須的，因為細(xì)胞經(jīng)過反復(fù)傳代后，突變和交叉污染的概率極大。所以實驗中對所用的細(xì)胞系進(jìn)行質(zhì)量控制，排除錯誤和發(fā)生交叉污染的細(xì)胞，使后續(xù)結(jié)果更為準(zhǔn)確、客觀。美國國立衛(wèi)生研究院和美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）等機(jī)構(gòu)建議在實驗前需要對所使用細(xì)胞系進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。雖然用于細(xì)胞鑒別的技術(shù)有很多，包括染色體檢查、同工酶譜檢測、PCR檢測及STR基因分型。然而都具有其相應(yīng)的缺點：染色體檢查對人員技術(shù)要求較高，同工酶檢測只能用于鑒定細(xì)胞種屬，且操作繁瑣；研究表明進(jìn)行細(xì)胞交叉污染和性質(zhì)鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)是STR基因分型檢測。STR基因分型應(yīng)用于細(xì)胞鑒定已被ATCC等機(jī)構(gòu)強烈推薦。鑒定流程包括提取細(xì)胞的基因組DNA，熒光引物PCR擴(kuò)增STR位點，PCR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳，專業(yè)軟件分析。最后是與STR的數(shù)據(jù)庫比對，比對數(shù)據(jù)庫為美國的ATCC細(xì)胞庫、德國菌種保藏中心、日本研究用生物資源保藏中心。ATCC網(wǎng)站的人源細(xì)胞STR鑒定結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：受檢細(xì)胞STR位點的基因分型數(shù)據(jù)與其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系STR基因分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比對：（1）若兩者的匹配度為100%，則判定受檢細(xì)胞系為ATCC STR數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系。（2）若兩者的匹配度80%～99%，則判定受檢細(xì)胞系為ATCC STR數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系的衍生細(xì)胞系。（3）若兩者的匹配度57%～79%，建議結(jié)合細(xì)胞系形態(tài)、細(xì)胞系特異性標(biāo)記物等輔助分析進(jìn)行綜合判斷。（4）若兩者的匹配度≤56%，則判定受檢細(xì)胞樣本與其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系不相關(guān)。

3.STR在異基因造血干細(xì)胞移植中的應(yīng)用

異基因造血干細(xì)胞移植中因為移植物的抗白血病效應(yīng)，現(xiàn)今已經(jīng)成為臨床上各種惡性及非惡性血液病治療的一項重要措施[4]，移植后的療效、移植后出現(xiàn)的移植物排斥、移植物抗宿主病（GVHD）、原發(fā)疾病復(fù)發(fā)及均與供受者造血及免疫系統(tǒng)的嵌合狀態(tài)密切相關(guān)[5]，供者細(xì)胞植入受者體內(nèi)后供者細(xì)胞及受者細(xì)胞含量情況是動態(tài)變化的，動態(tài)定期監(jiān)測供受者細(xì)胞嵌合率可以及早發(fā)現(xiàn)排斥、復(fù)發(fā)并及時干預(yù)治療，對降低移植后復(fù)發(fā)率，有效控制GVHD，提高患者的生存率具有十分重要的意義。

嵌合狀態(tài)指的是在異基因造血干細(xì)胞移植后，供者細(xì)胞植入到受者體內(nèi)，供受者雙方的造血細(xì)胞達(dá)到共存的現(xiàn)象。移植后供者細(xì)胞在受者細(xì)胞的百分比即為供者細(xì)胞嵌合率；異基因造血干細(xì)胞移植之后可出現(xiàn)三種狀態(tài)：（1）完全供者嵌合狀態(tài)，是指供者細(xì)胞占受者的骨髓或外周血細(xì)胞的比例≥99%，此時可以是認(rèn)為當(dāng)時檢測的時間點是移植成功的，沒有復(fù)發(fā)；（2）供受者混合嵌合（供者細(xì)胞嵌合率5%～95%），是指檢測結(jié)果中既有患者細(xì)胞又有供者細(xì)胞，此時是否是一個供者細(xì)胞正在增殖或者是復(fù)發(fā)的狀態(tài)，需要一個連續(xù)的監(jiān)測過程確認(rèn)；（3）完全受者型（供者細(xì)胞嵌合率＜5%），此狀態(tài)表明的結(jié)果是移植失敗或者完全復(fù)發(fā)，同樣需要一個連續(xù)的監(jiān)測過程確認(rèn)。

至今嵌合率的檢測方法主要有熒光原位雜交（FISH）技術(shù)、可變串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）、實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RQ_PCR）檢測和STR. FISH技術(shù)的優(yōu)點在于敏感性高、可定量、快速、安全，但只能應(yīng)用于異性別移植后嵌合率監(jiān)測，VNTR與STR的敏感性及特異性均較高，檢測所需的細(xì)胞量也較少，且適用于幾乎全部供受者。但VNTR為人類DNA含有可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)序列的多態(tài)性位點，由長度為8～50 bp的重復(fù)序列組成；而STR則為長度2～6 bp的重復(fù)序列，可以顯示出高度的雜合性、多態(tài)性及個體化[3]，比VNTR敏感性更高。RQ-PCR檢測操作簡單迅速，所需細(xì)胞量較少，且檢測敏感性較高，但其缺點是前期需要通過復(fù)雜的篩選得到合適的供者[6]因此STR被廣泛應(yīng)用于移植后嵌合率的分析，是目前供者造血細(xì)胞植入和患者自體細(xì)胞殘留監(jiān)測的標(biāo)準(zhǔn)化方法，并且房建成老師還開發(fā)了一套基于毛細(xì)管電泳法進(jìn)行移植后嵌合率檢測時可自動數(shù)據(jù)分析和報告的工具軟件，以提高工作效率[7]，滿足了實驗室對數(shù)據(jù)管理規(guī)范化的要求，也實現(xiàn)檢測信息的數(shù)據(jù)庫化管理。

4.結(jié)語與展望

雖然STR分型檢測技術(shù)因其高靈敏度、高特異性、高鑒別能力在多個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但在鑒定實踐中利用CE技術(shù)進(jìn)行PCR-STR分型是基于其長度多態(tài)性，而忽略了其序列多態(tài)性[8]。而序列多態(tài)性可以增強STR遺傳標(biāo)記的多態(tài)性，是個體識別或親緣關(guān)系分析的寶貴資源，可提高其識別效能。隨著二代測序（NGS）技術(shù)的不斷成熟和推廣，其高通量、集成化、低成本、快速等優(yōu)勢不斷的顯現(xiàn)出來，龐敬博的調(diào)查研究表明NGS技術(shù)不但能夠檢測遺傳標(biāo)記的DNA序列，而且可以使基于PCR技術(shù)的DNA片段長度多態(tài)性和DNA序列多態(tài)性結(jié)合，從而得到基因座中所有序列長度相等可能具有遺傳穩(wěn)定性的完全不同的等位基因，以提高遺傳標(biāo)記的應(yīng)用效能。即基于NGS進(jìn)行STR序列多態(tài)性分型所獲得的等位基因數(shù)量遠(yuǎn)多于基于CE平臺的STR長度多態(tài)性分型，并且由長度多態(tài)水平擴(kuò)展到序列多態(tài)水平，對STR等位基因進(jìn)行更為精細(xì)化的區(qū)分，提供全解析度的STR數(shù)據(jù)支撐，顯著提升了STR基因座的個體識別效力[9]和檢測系統(tǒng)的效能，也能夠提高對微量和降解檢材的檢驗?zāi)芰10]。并且通過在目的基因兩端連接特異性的標(biāo)記序列來識別不同樣本，可以同時檢測數(shù)十上百個樣本，大大提高檢測效率，為其發(fā)展提供了更廣闊的空間和更多樣化的應(yīng)用前景。