寧夏地區(qū)蛋雞腸道中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及體外藥敏實(shí)驗(yàn)

薛甜霞 張冉 徐源佑 許佳敏 李海娟 王潔 邊海霞

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2021.11.038

摘要：試驗(yàn)采用腸道剖檢、細(xì)菌分離技術(shù)、細(xì)菌基因組測(cè)序與藥敏試驗(yàn)等方法進(jìn)行探討，首先從剖檢變化、菌落、菌體的形態(tài)、基因測(cè)序等方面對(duì)病原菌進(jìn)行了鑒定，腸道剖檢過(guò)程中可見(jiàn)腸管體積增加，內(nèi)部臌氣，腸內(nèi)容物呈類(lèi)西紅柿樣和類(lèi)褐綠色樣。通過(guò)染色鏡檢觀察顯示為兩端鈍圓，呈桿狀，藍(lán)紫色。從菌落的形態(tài)學(xué)觀察，TSC-卵黃平板上呈現(xiàn)有白濁環(huán)的圓形的黑色菌落。進(jìn)行序列測(cè)定后提示此次分離得到的菌株與產(chǎn)氣莢膜梭菌同源性較高，其次經(jīng)藥敏結(jié)果說(shuō)明其對(duì)阿莫西林等5種測(cè)試藥物高度敏感，對(duì)鹽酸土霉素中敏，對(duì)硫酸新霉素等3種藥物耐藥。通過(guò)對(duì)寧夏蛋雞場(chǎng)壞死性腸炎疑似病例的病原及臨床防控研究，此次共分離到一株產(chǎn)氣莢膜梭菌，阿莫西林、氨芐青霉素、地美硝唑、鹽霉素與多西環(huán)素對(duì)該分離菌株有良好的抑制效果，而磺胺間甲氧嘧啶、硫酸新霉素與地克珠利則對(duì)分離菌株無(wú)抑制作用。本文以寧夏地區(qū)蛋雞為研究對(duì)象，研究場(chǎng)區(qū)出現(xiàn)的壞死性腸炎疑似病例的病原及其針對(duì)性敏感藥物，為雞壞死性腸炎的臨床防控提供參考數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：壞死性腸炎;產(chǎn)氣莢膜梭菌;臨床防控

產(chǎn)氣莢膜梭菌（又名魏氏梭菌）引起的壞死性腸炎是養(yǎng)禽業(yè)危害最大的疾病之一，尤其是飼料禁抗后，雞壞死性腸炎作為一種“復(fù)燃疾病”給養(yǎng)禽行業(yè)帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。關(guān)于肉雞中魏氏梭菌的致病力、防控措施等都取得一定研究進(jìn)展。但對(duì)于產(chǎn)蛋雞飼養(yǎng)中魏氏梭菌的研究還較少。因此，筆者以寧夏地區(qū)蛋雞場(chǎng)出現(xiàn)的壞死性腸炎疑似病例主要致病菌為研究對(duì)象，對(duì)寧夏地區(qū)蛋雞場(chǎng)展開(kāi)調(diào)查，以期為場(chǎng)區(qū)臨床用藥和防控提供一定參考方案。

1 方法

本研究將腸道剖檢后采集到的腸內(nèi)容物加入PBS溶液，渦旋震蕩混勻后靜置，吸取上清適量于FT液體培養(yǎng)基中，40℃厭氧培養(yǎng)16～24h。將增菌后的培養(yǎng)物充分搖勻，以超純水進(jìn)行不同濃度梯度稀釋。用涂布棒依次按低濃度至高濃度順序均勻涂布于制備好的平板上，待菌液充分吸收后覆蓋一層TSC選擇性培養(yǎng)基，40℃厭氧培養(yǎng)16～24h。選取疑似菌落接種于FT中培養(yǎng)16～24h，在產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定培養(yǎng)基上進(jìn)一步分離純化，經(jīng)多次純化培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭氏染色觀察。將得到的培養(yǎng)物提取DNA，將其作為模板，利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：2xPCR-Mix 10μL，模板2μL，10μmol/L上下游引物各0.8μL，補(bǔ)充ddH2O至總反應(yīng)體系為20μL，后執(zhí)行下列反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min;95℃變性45s;55℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min后結(jié)束反應(yīng)。之后將回收純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)將測(cè)序結(jié)果先進(jìn)行BLAST程序比對(duì)，再?gòu)闹羞x取相似性較高的代表菌株16S rRNA序列，用MEGA 10.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。將待測(cè)試藥物稀釋為相應(yīng)的使用濃度，再用FT液體培養(yǎng)基將菌株復(fù)蘇和培養(yǎng)16～24h。最后將高壓滅菌后的牛津杯均勻放在下層瓊脂平板上，LB-瓊脂培養(yǎng)基與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液均勻混合，凝固后于每孔中加入待測(cè)藥物，設(shè)置對(duì)照孔，40℃厭氧培養(yǎng)16～24h。根據(jù)抑菌圈直徑判定該菌株對(duì)測(cè)試藥物的敏感性。

2 結(jié)果

在厭氧條件下，從雞壞死性腸炎疑似病例中經(jīng)FT液體培養(yǎng)基與TSC卵黃瓊脂分離純化，并經(jīng)革蘭氏染色觀察可見(jiàn)兩端鈍圓、單排或雙排形式的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，并將分離菌株命名為XM21F。軟件分析后表明測(cè)序得到的分離菌株序列與產(chǎn)氣莢膜梭菌序列的同源性較高，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)后顯示XM21F與產(chǎn)氣莢膜梭菌（clostridium perfringens）位于同一分支，表明分離菌為產(chǎn)氣莢膜梭菌，進(jìn)一步確定分離菌株的所屬類(lèi)別。藥敏結(jié)果則顯示分離菌株對(duì)阿莫西林、氨芐青霉素、地美硝唑、鹽霉素、多西環(huán)素這5種藥物高度敏感，對(duì)鹽酸土霉素中度敏感，對(duì)硫酸新霉素、復(fù)方磺胺嘧啶、復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉這3種藥物耐藥。

3 討論

國(guó)內(nèi)外當(dāng)下普遍使用的魏氏梭菌鑒定方法即是采用PCR方法檢測(cè)待測(cè)細(xì)菌毒素基因^[1]，本次研究將回收純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行序列測(cè)定，經(jīng)分析后確定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。產(chǎn)氣莢膜梭菌（clostridium perfringens）引起的雞壞死性腸炎是對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害最大的疾病之一，僅次于球蟲(chóng)對(duì)蛋雞的危害，給蛋雞行業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失^[2]。伴隨著抗生素的使用標(biāo)準(zhǔn)越來(lái)越嚴(yán)格，家禽壞死性腸炎的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)^[3，4]?？股氐人幬镆殉蔀榭刂萍仪莓a(chǎn)氣莢膜梭菌感染的有效治療措施^[5]。然而，由于抗生素耐藥菌的出現(xiàn)和抗生素對(duì)微生物菌群的影響^[6]，使雞產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生了嚴(yán)重耐藥性，為臨床治療時(shí)選擇用藥帶來(lái)了巨大困難^[7]。文章對(duì)分離菌株--產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，篩選出臨床上對(duì)此治療效果較顯著的藥物。結(jié)果顯示，阿莫西林和氨芐青霉素等對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌具有良好的抑菌效果，而鹽酸土霉素弱于阿莫西林與氨芐青霉素等藥物，地克珠利與硫酸新霉素對(duì)該分離菌無(wú)明顯抑制作用。根據(jù)文章研究結(jié)果來(lái)看，養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行雞壞死性腸炎防控時(shí)，可以?xún)?yōu)先進(jìn)行病原的藥敏實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)結(jié)果選用高敏藥物添加在飼料中，不僅能預(yù)防疾病，降低腸炎發(fā)病率，又可以減少場(chǎng)區(qū)經(jīng)濟(jì)損失，從而保證產(chǎn)蛋率，確保經(jīng)濟(jì)效益的最大實(shí)現(xiàn)。Gong等^[8]的研究指出植物乳桿菌與多黏菌擬桿菌通過(guò)改善腸道微生物群的組成和代謝途徑、腸道結(jié)構(gòu)等能夠抗產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染。通過(guò)此次研究，也發(fā)現(xiàn)場(chǎng)區(qū)發(fā)生的腸炎疑似病例是在產(chǎn)蛋期時(shí)出現(xiàn)。對(duì)蛋雞而言，產(chǎn)蛋期尤為關(guān)鍵，則對(duì)雞壞死性腸炎的防控就顯得尤為重要。因此，在對(duì)雞壞死性腸炎進(jìn)行整體防控時(shí)，可以多措并舉，如在飼料中添加適量乳桿菌等制劑，同時(shí)注重飼養(yǎng)過(guò)程中的雞群腸道發(fā)育，則對(duì)改善雞群整體健康狀況有良好的促進(jìn)作用，其次處理好雞舍環(huán)境衛(wèi)生，規(guī)范消毒，合理調(diào)整飼養(yǎng)密度，及時(shí)通風(fēng)換氣，再用敏感藥物進(jìn)行預(yù)防，就能夠?qū)乃佬阅c炎病例達(dá)到一個(gè)有效的綜合防控效果。

4 結(jié)論

從寧夏地區(qū)蛋雞場(chǎng)壞死性腸炎疑似病例中分離到一株產(chǎn)氣莢膜梭菌，對(duì)分離菌株進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn)后，顯示阿莫西林、氨芐青霉素、地美硝唑、鹽霉素與多西環(huán)素對(duì)分離菌株有良好的抑制作用，而鹽酸土霉素對(duì)分離菌株的抑制作用則弱于阿莫西林與氨芐青霉素等藥物，硫酸新霉素、地克珠利與磺胺間甲氧嘧啶鈉對(duì)分離菌株無(wú)抑制作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 田麗娜，程穎，盧金星.致病梭菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2013，29（5）：490-493.

[2] 陳海寧，廖申權(quán)，戚南山，等.雞產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（12）：228-232.

[3] 鄭曉麗.規(guī)?；u場(chǎng)健康雞群產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離、鑒定及遺傳多樣性研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[4] 張艷，李蘭蘭，黃藝華，等.雞產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2015，51（4）：73-76.

[5] J.P. Dahiya， D.C. Wilkie， A.G. Van Kessel， et al. Potential strategies for controlling necrotic enteritis in broiler chickens in post-antibiotic era[J]. Animal Feed Science and Technology， 2005， 129（1）：60-88.

[6] Shojadoost Bahram， Vince Andrew R， Prescott John F. The successful experimental induction of necrotic enteritis in chickens by Clostridium perfringens： a critical review[J]. Veterinary research， 2012（43）：74.

[7] Lindstrüm Miia， Heikinheimo Annamari， Lahti P?ivi， et al. Novel insights into the epidemiology of Clostridium perfringens type A food poisoning[J]. Food microbiology， 2011， 28（2）：192-198.

[8] Gong Li， Wang Baikui， Zhou Yuanhao， et al. Protective Effects of Lactobacillus plantarum 16 and Paenibacillus polymyxa 10 Against Clostridium perfringens Infection in Broilers[J]. Frontiers in Immunology， 2021（11）：3934.

*通訊作者