子宮內(nèi)膜異位癥患者自然周期卵泡液中細(xì)胞因子研究

吳庚香，Nick Bersinger，Michael Mueller，Michael von Wolff

(1. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北省輔助生殖與胚胎發(fā)育醫(yī)學(xué)臨床研究中心，武漢 430060；2.瑞士伯爾尼大學(xué)婦女醫(yī)院婦科內(nèi)分泌與生殖醫(yī)學(xué)科，伯爾尼 3010)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是婦科的常見病，發(fā)病率約為5%～10%，是導(dǎo)致患者不孕的原因之一，但其引起不孕的機制至今尚未完全闡明。目前認(rèn)為異位的內(nèi)膜組織使機體發(fā)生自身免疫應(yīng)答異常，引起包括盆腔和卵巢局部在內(nèi)的廣泛炎癥反應(yīng)[1]。EMs合并不孕患者卵巢儲備功能下降，卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量下降，影響IVF臨床結(jié)局[2]。本研究通過觀察EMs患者自然周期卵泡液中細(xì)胞因子的成分變化，探討EMs患者生育力低下的原因。

資料與方法

一、研究對象

募集2013～2016年間在瑞士伯爾尼大學(xué)婦女醫(yī)院生殖中心因EMs行自然周期IVF-ET或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)助孕治療的17例患者為研究對象(EMs組)，年齡26～42歲，平均年齡(35.7±3.7)歲。根據(jù)美國生殖醫(yī)學(xué)會EMs分類修訂版對患者內(nèi)異癥程度進(jìn)行分期，I～Ⅱ期為輕度EMs組，共7例；Ⅲ～Ⅳ期為中重度EMs組，共10例。同時募集同期17例年齡匹配、因輸卵管因素或男方因素在該中心行自然周期IVF/ICSI-ET助孕的患者做為對照組。所有患者3個月內(nèi)均無感染性疾病及服用藥物史。本研究得到了醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，每位患者均簽署了知情同意書。

二、標(biāo)本收集

所有患者均采用自然周期移植，通過陰道B超及血清LH和E2濃度監(jiān)測卵泡生長。當(dāng)卵泡直徑達(dá)到18 mm且血清E2濃度達(dá)到800 pmol/L時，當(dāng)晚給予5 000 IU人絨毛膜促性腺激素(HCG，Pregnyl?，MSD，瑞士)肌肉注射，36 h后經(jīng)陰道取卵。取卵時收集卵泡液，600g離心10 min，再以1 300g離心10 min，收集上清液，儲存于-70℃待檢測。

三、細(xì)胞因子檢測

白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-15、IL-18，調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)與分泌的趨化因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)，腫瘤壞死因子(TNF)-α，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，白血病抑制因子(LIF)等9種細(xì)胞因子使用定制的9因子試劑盒(Bio-Rad Laboratories，USA)，在Bio-Plex?平臺按照試劑說明書進(jìn)行檢測(Bio-Rad Laboratories，USA)，卵泡液使用試劑盒中的樣品稀釋液按1∶3的比例進(jìn)行稀釋。以Bio-Plex管理軟件6.1版進(jìn)行原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換、分析和標(biāo)準(zhǔn)曲線的計算。單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemotactic factor-1，MCP-1)和瘦素(Leptin)使用R&D Systems(Abingdon，英國)的Duo-Set微孔板ELISA法檢測，使用含1%(w/v) 牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液分別以1∶2和1∶50的比例進(jìn)行稀釋。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計分析，計量資料采用中位數(shù)及范圍值表示，組間比較采用配對Wilcoxon檢驗，各細(xì)胞因子間相互關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、卵泡液中細(xì)胞因子濃度

IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、Leptin、VEGF、MCP-1和LIF在所有患者的卵泡液標(biāo)本中均可檢出，而IL-15、RANTES和TNF-α僅分別能在極少部分患者的卵泡液中檢出[分別為5.9%(2/34)，8.8%(3/34)和5.9%(2/34)]。其中IL-1β和IL-6在EMs患者卵泡液中的濃度顯著高于對照組(中位數(shù)比較分別為0.8 pg/ml vs. 0 pg/ml和9.1 pg/ml vs. 6.1 pg/ml)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而其他幾種細(xì)胞因子濃度在兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 采卵日卵泡液中細(xì)胞因子濃度[中位數(shù)(最小值～最大值)]

注：與對照組比較，*P<0.05

二、不同分期的EMs患者卵泡液中細(xì)胞因子濃度比較

通過對輕度及中重度EMs患者卵泡液中細(xì)胞因子濃度的比較發(fā)現(xiàn)，中重度EMs患者卵泡液中IL-1β濃度(1.44 pg/ml)顯著高于輕度EMs及對照組(分別為0.26 pg/ml、0 pg/ml)，VEGF濃度(2 464 pg/ml)亦顯著高于輕度EMs及對照組(分別為1 268 pg/ml、1 560 pg/ml)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而IL-6、IL-8、IL-18、Leptin、MCP-1和LIF等幾種細(xì)胞因子濃度在各組間無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

三、卵泡液中細(xì)胞因子濃度與EMs分期相關(guān)性關(guān)系

通過Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)卵泡液中只有IL-1β和IL-6的濃度與EMs分期相關(guān)，大部分細(xì)胞因子濃度相互之間存在較強的相關(guān)性，且均為正相關(guān)，尤其是VEGF與MCP-1兩種細(xì)胞因子，與所檢測的其他細(xì)胞因子基本都相關(guān)；而Leptin則相反，除與VEGF相關(guān)外，與所檢測的其他細(xì)胞因子均不相關(guān)(表2)。

注：與輕度EMs和對照組比較，*P<0.05圖1 不同EMs分期患者卵泡液中細(xì)胞因子的表達(dá)水平

表2 EMs與卵泡液中細(xì)胞因子濃度的Spearman相關(guān)性分析(r)

注：*P<0.05，**P<0.01

討 論

EMs被認(rèn)為是一種慢性進(jìn)行性炎癥疾病，有研究報道在EMs患者的腹腔液和血液中某些細(xì)胞因子水平增高，如IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、VEGF等[3-6]。而卵泡液是由卵巢的顆粒細(xì)胞分泌及血液擴散而來，因此EMs疾病狀態(tài)下卵泡液中的細(xì)胞因子微環(huán)境可能也會受到影響。而卵泡的生長發(fā)育、排卵以及黃體形成等過程均涉及多個細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)[7]。卵泡液中含有多種生物活性分子和蛋白，構(gòu)成排卵前卵泡生長和發(fā)育的微環(huán)境，因此卵泡液中細(xì)胞因子的改變必然會導(dǎo)致卵母細(xì)胞生長的微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而直接影響卵母細(xì)胞完成減數(shù)分裂和受精的能力以及形成胚胎的能力[8]。EMs患者體內(nèi)異常的細(xì)胞因子可能通過影響上述多個環(huán)節(jié)而導(dǎo)致其生殖功能障礙，導(dǎo)致EMs患者不孕癥發(fā)生率增高、IVF妊娠結(jié)局較差。然而，既往關(guān)于EMs卵泡液的研究結(jié)果基本上都來自于常規(guī)IVF周期即超促排卵周期，在外源性促性腺激素刺激下，卵泡的激素微環(huán)境及血清中的免疫系統(tǒng)都會受到相應(yīng)的影響[9-10]。因此這種條件下獲得的卵泡液不能反映EMs疾病狀態(tài)下卵泡液中真實的細(xì)胞因子變化。本研究收集的是自然周期IVF患者采卵日的卵泡液，只在扳機日使用了外源性的HCG，卵泡液受藥物的影響程度已降至最低，基本可完全反映卵泡液在生理狀態(tài)下的真實狀態(tài)，因此自然周期IVF被認(rèn)為是研究卵泡液微環(huán)境最理想的模型[9，11]。

本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β和IL-6的水平在EMs患者的卵泡液中顯著高于對照組(P<0.05)，且其濃度與EMs分期顯著相關(guān)。IL-1β是一種可通過多種方式促進(jìn)EMs發(fā)展的多效細(xì)胞因子，在EMs的形成和進(jìn)展中具有重要作用[12]。EMs患者腹腔液中IL-1β濃度明顯高于正常對照組[13]，深部浸潤型EMs患者血清中IL-1β濃度也明顯高于淺表型EMs患者及正常對照組，提示IL-1β的異?？赡芸梢杂绊慐Ms的病理生理。Pellicer等[3]發(fā)現(xiàn)EMs患者的卵泡液中IL-1β濃度高于正常對照組，本研究結(jié)果與其一致，但Pellicer的結(jié)果尚無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與其樣本量太小有關(guān)。IL-1β對IVF妊娠結(jié)局的影響目前還存在爭議，Asimakopoulos 等[14]發(fā)現(xiàn)IVF周期中妊娠的患者其血清中IL-1β的濃度低于未妊娠者，但卵泡液中的IL-1β濃度卻高于未妊娠者。而Zollner等[15]報道卵泡液中高濃度的IL-1β與更高的受精率相關(guān)。因此，EMs患者卵泡液中IL-1β的作用還需進(jìn)一步大樣本的研究探討。

IL-6被認(rèn)為是一種對卵丘細(xì)胞功能、卵冠丘復(fù)合物的擴張及卵母細(xì)胞功能具有自分泌調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子[16]。有證據(jù)顯示IL-6還可以直接影響卵巢功能，并對生育功能具有重要調(diào)節(jié)作用。卵泡液中IL-6水平的增高可能影響卵母細(xì)胞質(zhì)量，并且可以降低卵泡中芳香化酶的活性，導(dǎo)致卵泡液中雌激素水平下降，進(jìn)而導(dǎo)致生育力下降。寧艷春[17]發(fā)現(xiàn)EMs患者卵巢卵泡液中IL-6等細(xì)胞因子表達(dá)升高，認(rèn)為這些細(xì)胞因子制造了卵母細(xì)胞生長發(fā)育的炎性微環(huán)境，使卵母細(xì)胞周圍的卵丘顆粒細(xì)胞生長發(fā)育情況變差，凋亡增多，分泌雌激素的功能受到影響，且體外實驗發(fā)現(xiàn)炎性卵泡液培養(yǎng)微環(huán)境可降低體外未成熟卵母細(xì)胞的成熟率。Pellicer等[3]也發(fā)現(xiàn)EMs患者卵泡液和血清中IL-6濃度均高于正常對照組，本研究結(jié)果與其一致。

VEGF被認(rèn)為是誘導(dǎo)血管生成的最重要、最關(guān)鍵的因子，在血管形成中起中心調(diào)節(jié)作用，是EMs發(fā)展的關(guān)鍵因子，參與EMs患者異位內(nèi)膜生長并導(dǎo)致患者不孕。研究發(fā)現(xiàn)EMs組患者血清和卵泡液中VEGF水平均顯著高于對照組(P<0.001)[18]，且EMs患者血清VEGF水平與EMs分期呈正相關(guān)(P<0.001)[19]。在本研究中，EMs組卵泡液中VEGF水平并未明顯高于對照組，但中重度EMs患者其卵泡液中VEGF濃度顯著高于輕度EMs及對照組(P<0.05)，提示VEGF的濃度與EMs嚴(yán)重程度相關(guān)。MCP-1是一種對單核細(xì)胞具有特異性趨化和激活活性的細(xì)胞因子，參與EMs的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)MCP-1對VEGF表達(dá)有正相調(diào)節(jié)作用，能夠誘導(dǎo)機體內(nèi)皮細(xì)胞遷移，使其參與血管生成這一生理活動，促進(jìn)EMs的病理進(jìn)程[20]。本研究通過細(xì)胞因子的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)在卵泡液中VEGF與MCP-1的濃度亦成正相關(guān)性。EMs的發(fā)病機制涉及復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，這些細(xì)胞因子相互作用、相互影響，并參與多個細(xì)胞通路，因此彼此的變化都是密切相關(guān)的[21]。

綜上所述，不論是超促排卵周期還是自然周期，EMs患者卵泡液中細(xì)胞因子微環(huán)境都發(fā)生了變化，IL-1β和IL-6的濃度均明顯高于對照組，可能與EMs患者生育力降低有關(guān)。