養(yǎng)肝化瘀顆粒治療大鼠肝纖維化的藥效學(xué)研究

姜 楠，李懷長，牛艷艷，郭 靜

（山西省中醫(yī)院肝病科，山西太原 030012）

肝纖維化是由肝臟長期損傷、修復(fù)過程中產(chǎn)生的一種病理現(xiàn)象，患者可有乏力、食欲減退、厭油膩、右上腹不適等癥狀，其作為肝硬化的初級階段，若及時(shí)采取有效的控制、治療手段，可在很大程度上降低肝硬化失代償期和肝癌的發(fā)生率。目前，臨床尚無特異性和專一性的抗肝纖維化藥物，多采用調(diào)整生活作息、飲食或護(hù)肝藥物來對癥治療，并未達(dá)到預(yù)期效果[1]。近年來，臨床廣泛開展的中醫(yī)中藥抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究，取得了顯著的成果，中藥復(fù)方的多途徑、多層次、多靶位的藥理作用特點(diǎn)，在抗肝纖維化治療中顯示了特有的優(yōu)越性[2]。養(yǎng)肝化瘀顆粒為山西省中醫(yī)院制劑，由梁瑞敏主任醫(yī)師所創(chuàng)制，其含有丹參、牡蠣、鱉甲等多味中藥，具有活血、化瘀、消積的功效。為此，本研究選取了90只Wistar大鼠進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，旨在觀察養(yǎng)肝化瘀顆粒對肝纖維化大鼠肝功能和肝纖維化的影響，以期為臨床治療提供依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 Wistar大鼠90只，雌雄各半；鼠齡6～7周，平均（6.5±0.3）周；體質(zhì)量120～200 g，平均（160.6±20.5）g。所選動物均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0008。本實(shí)驗(yàn)方案已經(jīng)山西省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物與試劑 養(yǎng)肝化瘀顆粒（由山西省中醫(yī)院制劑中心提供，批號：20190527，規(guī)格：15 g/袋），藥物組成：丹參、鱉甲、黃芪各30 g，牡蠣、白芍、白術(shù)各20 g，生地、山茱萸各15 g，桃仁、紅花、郁金、木香、土元各10 g。秋水仙堿片（西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H53021369，規(guī)格：0.5 mg/片）。牛血清白蛋白（BSA）（上海研謹(jǐn)生物科技有限公司，批號：738328）；四氯化碳（CCl4）（北京化工廠，批號：080120）。總膽紅素液體試劑盒（上海鑫諾賽醫(yī)療器械有限公司）；Ⅳ型膠原測定試劑盒（鄭州安圖生物工程股份有限公司）；總蛋白試劑盒（北京北化康泰臨床試劑有限公司）；堿性磷酸酶測定試劑盒（長春匯力生物技術(shù)有限公司）；人腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長因子試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.1.3 儀器 低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；電熱恒溫水箱（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠）；電子天平（德國賽多利斯公司）；交直流電子計(jì)價(jià)秤（太原航空儀表有限公司）；紫外可見光分光光度計(jì)（日本島津株式會社）；自動酶標(biāo)分析儀（上海安泰分析儀器有限公司）；全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司）。

1.2 研究方法 90只大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組及高、中、低劑量組（給予養(yǎng)肝化瘀顆粒高、中、低劑量），共6組，每組15只。除正常對照組外，其余大鼠均制備肝纖維化模型，每只大鼠按照0.3 mL/100 g劑量腹腔注射20% CCl4溶液，同時(shí)按照0.3 mL/100 g皮下注射0.8%牛血清白蛋白（BSA）溶液，1次/周，連續(xù)注射5周[3]。自造模開始，陽性對照組大鼠給予秋水仙堿混懸液l mg/kg灌胃，高、中、低劑量組大鼠分別給予養(yǎng)肝化瘀顆粒30 g/kg、15 g/kg、7.5 g/kg灌胃，而正常組與模型對照組大鼠均以20 mL/kg生理鹽水灌胃，1次/d，至9周末結(jié)束。

1.3 觀察指標(biāo) ①肝功能指標(biāo)。分別于干預(yù)5周、9周后觀察大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBil）、堿性磷酸酶（ALP）水平變化，取各組大鼠尾靜脈血3 mL，以2 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，分離血清，采用全自動生化分析進(jìn)行檢測。于干預(yù)5周后采用斷頸方式處死各組8只大鼠，9周后處死各組剩余的7只。②肝纖維化指標(biāo)。分別于干預(yù)5周、9周后采用微磁?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（C-Ⅳ）、層黏連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA），采血與分離血清方式同①。③肝組織病理觀察。于干預(yù)9周后采用蘇木精 - 伊紅（HE）染色[4]法觀察分析大鼠肝組織病理形態(tài)，于倒置顯微鏡下觀察大鼠肝部組織變化情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料比較，采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝功能指標(biāo) 與正常對照組比較，干預(yù)5周后模型對照組大鼠AST、ALP及干預(yù)9周后TBil、ALP均升高；與模型組比較，干預(yù)5周后高、中劑量組大鼠TBil降低，干預(yù)9周后高、中、低劑量組大鼠ALT和高、中劑量組AST均降低；干預(yù)5周后高劑量組大鼠ALP和干預(yù)后9周AST低于低劑量組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 6組大鼠肝功能指標(biāo)比較（±s）

表1 6組大鼠肝功能指標(biāo)比較（±s）

注：與5周后比，*P＜0.05；與正常對照組比，#P＜0.05；與模型對照組比，△P＜0.05；與陽性對照組比，▲P＜0.05；與高劑量組比，□P＜0.05。ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALB：白蛋白；TBil：總膽紅素；ALP：堿性磷酸酶。

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2.2 肝纖維化指標(biāo) 與正常對照組比較，干預(yù)5周后模型對照組大鼠PCⅢ、C-Ⅳ、LN、HA及干預(yù)9周后C-Ⅳ、HA均升高；與模型組比較，干預(yù)5周后高、中、低劑量組大鼠C-Ⅳ、LN降低，干預(yù)9周后高、中、低劑量組大鼠C-Ⅳ和高劑量組HA均降低；干預(yù)后9周后高劑量組大鼠PCⅢ、C-Ⅳ和HA均低于低劑量組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 6組大鼠肝纖維化指標(biāo)比較（±s）

表2 6組大鼠肝纖維化指標(biāo)比較（±s）

注：與5周后比，＊P＜0.05；與正常對照組比，#P＜0.05；與模型對照組比，△P＜0.05；與陽性對照組比，▲P＜0.05；與高劑量組比，□P＜0.05。PCⅢ：Ⅲ型前膠原；C-Ⅳ：Ⅳ型膠原；LN：層黏連蛋白；HA：透明質(zhì)酸。

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2.3 9周后肝組織形態(tài)學(xué)改變 干預(yù)9周后，病理HE染色可見，正常對照組：未見匯管區(qū)擴(kuò)大及肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉內(nèi)未見炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)周圍無纖維化，肝細(xì)胞無變性，未見點(diǎn)灶狀壞死，見圖1-A。模型對照組：匯管區(qū)擴(kuò)大明顯，周圍纖維化，偶見碎屑樣壞死，纖維間隔形成，肝小葉內(nèi)可見輕度炎細(xì)胞浸潤，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，可見假小葉形成，肝細(xì)胞重度脂肪變性，見圖1-B。陽性對照組：匯管區(qū)輕度擴(kuò)大，周圍纖維化，纖維間隔形成，部分肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂或伴假小葉形成，見圖1-C。高劑量組：匯管區(qū)輕度擴(kuò)大，周圍輕度纖維化，偶見纖維間隔形成，肝細(xì)胞可見脂肪變性，肝小葉結(jié)構(gòu)趨于正常，見圖1-D。中、低劑量組：匯管區(qū)擴(kuò)大，周圍纖維化，可見纖維間隔形成，部分肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，見圖1-E、F。

圖1 大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)圖片（HE ，×400）

3 討論

肝纖維化貫穿于各種慢性肝病的始終，是肝臟長期損傷、修復(fù)過程中產(chǎn)生的一種病理現(xiàn)象，而若慢性肝病進(jìn)程未被有效控制，則可進(jìn)展為肝纖維化。目前臨床尚未有特異有效的抗肝纖維化的治療方法，主要以針對原發(fā)病與抗纖維化兩方面進(jìn)行干預(yù)，以達(dá)到阻滯肝纖維化進(jìn)一步進(jìn)展為肝硬化。

中醫(yī)認(rèn)為，肝纖維化屬于“黃疸”“鼓脹”等范疇，發(fā)展病機(jī)是以肝絡(luò)瘀阻為核心，正氣虧虛為關(guān)鍵，毒、虛、瘀互結(jié)為根本，因此，扶正活血、化瘀通絡(luò)是肝纖維化的主要治療原則。養(yǎng)肝化瘀顆粒中紅花、丹參能夠促進(jìn)機(jī)體吸收和清除沉著的抗原抗體復(fù)合物；牡蠣可斂陰潛陽、解毒化痰；鱉甲可增強(qiáng)免疫，減輕肝損傷；桃仁、土元可活血祛瘀、消散內(nèi)癰；黃芪可補(bǔ)氣固表、托毒排膿；生地可養(yǎng)陰生津、清熱涼血；郁金、木香可活血止痛、行氣解郁；山茱萸可生津止渴、補(bǔ)益肝腎；白芍可養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛的功效；白術(shù)可保肝益氣、燥濕利水，諸藥合用，共奏活血化瘀、養(yǎng)肝護(hù)肝的功效。相關(guān)學(xué)者認(rèn)為，活血化瘀藥物抗纖維化的機(jī)理主要是通過改善微循環(huán)與影響結(jié)締組織代謝，起到改善或恢復(fù)免疫功能穩(wěn)定性的作用[5]。本研究將眾藥合制為養(yǎng)肝化瘀顆粒，用于研究對肝纖維化的治療效果，發(fā)現(xiàn)與模型對照組比較，干預(yù)5周和9周后，高、中、低劑量組大鼠血清肝功能各項(xiàng)指標(biāo)有不同程度的降低；干預(yù)9周后檢測，高劑量組大鼠AST顯著低于陽性對照組，證實(shí)了不同劑量養(yǎng)肝化瘀顆粒干預(yù)均可一定程度上改善大鼠的肝功能指標(biāo)，具有一定的護(hù)肝效果。

有研究表明，肝纖維化與肝血瘀阻之間存在著本質(zhì)的聯(lián)系，微循環(huán)障礙可導(dǎo)致肝竇狹窄、閉塞甚至消失，肝竇內(nèi)紅細(xì)胞聚集，微血栓形成，而養(yǎng)肝化瘀顆粒有抑制過氧化脂質(zhì)，激活超氧化物歧化酶的作用，從而提高機(jī)體對自由基的清除率，在炎癥早期滲出性階段發(fā)揮抗炎作用，并能抑制炎癥的晚期增殖病變，促進(jìn)組織修復(fù)再生[6]。另有學(xué)者認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞活化，有可能促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展，最終導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)或功能異常的病理變化，因此，肝纖維化指標(biāo)在一定程度上反映了細(xì)胞外基質(zhì)與其降解產(chǎn)物在肝內(nèi)的生成與沉積[7]。PCⅢ、C-Ⅳ、LN、HA均為評估肝纖維化常用指標(biāo)，其與肝纖維化發(fā)展程度密切相關(guān)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白芍可抑制谷丙轉(zhuǎn)氨酶的升高與乳酸脫氫酶活性的增高，從而起到抗炎護(hù)肝的效果；黃芪可利于促進(jìn)機(jī)體清除自由基，增強(qiáng)免疫力[8-9]。本研究中，與模型對照組比較，干預(yù)5周和9周后，高、中、低劑量組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)也均有不同程度的降低，且部分指標(biāo)和陽性對照組水平相當(dāng)，同時(shí)病理HE染色可見，高、中、低劑量組大鼠肝組織病理較模型對照組明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)逐漸趨于正常，肝纖維化程度減輕，提示養(yǎng)肝化瘀顆粒對復(fù)合因素誘發(fā)條件下的大鼠肝細(xì)胞損傷均有較好保護(hù)和治療作用，并可間接抑制肝星狀細(xì)胞活化與增殖、對肝臟內(nèi)膠原的合成及分解均有不同程度的影響，控制細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積，能夠起到防治肝纖維化的局部效應(yīng)。

綜上，養(yǎng)肝化瘀顆粒對CCl4聯(lián)合BSA所致的大鼠肝纖維化有明顯的干預(yù)和治療作用，對大鼠肝損傷具有保護(hù)作用；整個(gè)方劑注重整體病機(jī)，著眼局部變化，可控制或逆轉(zhuǎn)肝纖維化，但其作用機(jī)制仍有待臨床進(jìn)一步研究。