桑椹花青素合成相關(guān)基因的鑒定及其功能研究

王 真

（中國海洋大學(xué)，山東青島 266100）

桑椹營養(yǎng)價(jià)值異常豐富，富含大量花青素，對于清除人體自由基、延緩衰老有著十分積極的意義。桑椹果實(shí)中大量的花青素由葉綠素轉(zhuǎn)化而來，作為一種黃酮類化合物，桑椹花青素分子當(dāng)中存有高度分子共軛體系，合成過程比較復(fù)雜，眾多的結(jié)構(gòu)基因及調(diào)控基因參與其中，各種代謝酶是花青素形成的關(guān)鍵，對其基因合成途徑進(jìn)行研究能夠?qū)崿F(xiàn)分子水平的調(diào)控，從生物學(xué)角度完成果品改良，提升桑椹中的花青素含量，從而創(chuàng)造更多的營養(yǎng)價(jià)值以及經(jīng)濟(jì)效益。

1 花青素合成途徑相關(guān)基因研究

1.1 花青素合成途徑

第1階段：在該階段的苯丙烷途徑中，苯丙氨酸作為花色素苷的生物合成前體，是整個(gè)合成過程的基礎(chǔ)，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的作用調(diào)控之下發(fā)生氨基脫去反應(yīng)，形成反式肉桂酸，在肉桂酸-4-羥化酶（C4H）以及4-香豆酰CoA連接酶的催化作用下，經(jīng)過一連串的酶促反應(yīng)而形成次生代謝中間物質(zhì)香豆酰輔酶A[1]。

第2階段：該階段為類黃酮代謝的關(guān)鍵，香豆酸輔酶A與丙二酰輔酶A經(jīng)由查爾酮合酶（CHS）以及查爾酮異構(gòu)酶（CHI）的催化作用下形成柚皮素，在黃烷酮-3-羥化酶基因活性的調(diào)控之下將香豆酸輔酶A轉(zhuǎn)化為類黃酮母核結(jié)構(gòu)。

第3階段：該階段為花青素的初步合成階段，由多種酶共同參與調(diào)控，主要表現(xiàn)為二氫黃酮醇還原酶（DFR）經(jīng)過催化作用形成無色花色素，再在花青素合成酶（ANS）及雙加氧酶（LDOX）的催化調(diào)控下完成無色花色素經(jīng)過氧化脫水實(shí)現(xiàn)到有色的過程，同時(shí)在類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT）的調(diào)控下形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的花色素苷，形成青素的基本碳骨架[2]。

第4階段：該階段為花青素基本碳骨架的修飾階段，有羥基化、甲基化、糖基化以及?；榷喾N形式，在一個(gè)或者是多個(gè)點(diǎn)位之間完成，不同的修飾過程完成之后可以形成不同的花色素，經(jīng)過修飾后的花青素?zé)o論在穩(wěn)定性、光吸收度還是水溶性等方面都得到了明顯的提升，花青素苷經(jīng)過積累以轉(zhuǎn)運(yùn)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）為介質(zhì)匯集儲(chǔ)存于液泡。

1.2 花青素合成代謝基因

1.2.1 花青素合成代謝相關(guān)結(jié)構(gòu)基因

（1）查爾酮合成酶基因（CHS）。作為類黃酮合成代謝過程中遇到的首要酶基因，其表達(dá)量決定了花青素顏色變化，CHS的關(guān)鍵作用在于催化4-香豆酸CoA與丙二酰CoA合成查爾酮，為類黃酮碳骨架的形成構(gòu)建基礎(chǔ)[3]。作為一個(gè)多基因家族，CHS基因編碼結(jié)構(gòu)在不同科目的植物之間表現(xiàn)出的保守性較為明顯，植物生長過程中CHS缺乏，則會(huì)導(dǎo)致類黃酮難以產(chǎn)生。

（2）查爾酮異構(gòu)酶基因（CHI）。作為類黃酮合成的關(guān)鍵酶，能夠完成對類黃酮當(dāng)中化合物含量的調(diào)節(jié)，CHI的基因編碼是一種功能性單體，其豐度的變化對于植物體內(nèi)的黃酮物質(zhì)含量有著直接的影響，即便在不通過植物當(dāng)中也有較高的氨基酸序列相似性，但與其他蛋白質(zhì)有所差異。

（3）黃烷酮3-羥化酶基因（F3H）。作為類黃酮代謝調(diào)控的重要基因，F(xiàn)3H是一種關(guān)鍵結(jié)構(gòu)酶，該基因呈現(xiàn)出一定的底物特異性，是作用于合成過程中的重要分支，在其催化作用下可以產(chǎn)生二氫黃酮醇類物質(zhì)，但其作為一種加氧酶故在反應(yīng)時(shí)需要Fe2+、O2等輔助因子的參與。不同植物當(dāng)中的F3H表達(dá)模式以及基因拷貝數(shù)皆不同。

（4）二氫黃酮醇-4-還原酶基因（DFR）。作為花色素合成后期的關(guān)鍵酶，DFR的作用在于催化二氫黃酮醇促使其形成無色花色素，屬于還原酶家族具備單基因編碼特性，可以在NADPH的輔助下還原羰基為羥基，DFR的調(diào)控作用異常復(fù)雜具有一定的保守性，不同植物的不同生長時(shí)期和不同組織部位DFR的基因表達(dá)特性不同。

（5）花色素苷合酶基因（ANS）。作為花青素合成過程中的有色化合物，ANS屬于雙加氧酶家族，能夠?qū)o色原花青素催化氧化轉(zhuǎn)換為有色，其作用于花青素合成的最后階段，是一種小基因結(jié)構(gòu)，具有明顯的組織特異性。

1.2.2 花青素合成代謝相關(guān)調(diào)控基因

（1）MYB轉(zhuǎn)錄因子。作為一種DNA融合蛋白質(zhì)，MYB結(jié)構(gòu)域是一個(gè)高度保守的DNA序列，既具有特定的結(jié)合活性，也具有特定的序列特異性，在MYB結(jié)構(gòu)域含有大約52種氨基酸，具有保守特征的氨基酸殘基可以使MYB蛋白質(zhì)折疊為不同的螺旋-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，MYB轉(zhuǎn)錄因子既可以完成植物花青素合成正向調(diào)節(jié)，也可以對植物內(nèi)的MYB蛋白質(zhì)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。

（2）堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子（bHLH）。作為植物中的第二大轉(zhuǎn)錄因子家族，bHLH最大的功能在于類黃酮以及花青素的合成調(diào)節(jié)，該類轉(zhuǎn)錄因子的蛋白結(jié)構(gòu)較為保守，每個(gè)bHLH基序都含有超過60種的氨基酸殘基，包含DNA結(jié)合區(qū)以及HLH兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別由大量堿性氨基酸以及疏水氨基酸組成[4]。

（3）WD40轉(zhuǎn)錄因子。作為一類大蛋白家族，WD40機(jī)構(gòu)具有高度保守的特點(diǎn)，含有4～16個(gè)不等基元序列，同時(shí)每個(gè)基元序列大約有41種氨基酸組成。整個(gè)花青素的合成過程中，WD40蛋白位于同一個(gè)進(jìn)化分支，能夠同bHLH轉(zhuǎn)錄因子或MYB類轉(zhuǎn)錄因子在共同的激活或者抑制作用下調(diào)控結(jié)構(gòu)基本的表達(dá)，完成對花青素合成的調(diào)控。

2 桑椹高通量鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建及測序

2.1 不同發(fā)育時(shí)期桑椹轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建

分別對青果期桑椹（MG）、紅果期桑椹（MR）以及紫熟期桑椹（MP）構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測序文庫，并利用Illumina Solexa測序技術(shù)完成鏈特異性測序分析，利用Trinity軟件將所得到的數(shù)據(jù)完成拼接組裝，利用BLAST軟件分別完成GO、KOG等數(shù)據(jù)庫的基因序列對比，參照分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄本注釋結(jié)果完成差異表達(dá)的lncRNAs以及mRNAs的鑒定。

2.2 不同發(fā)育時(shí)期桑椹中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜

分別對不同時(shí)期的lncRNA進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，同時(shí)完成上下頻數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明lncRNA比mRNA水平離散度更低，同時(shí)在生物學(xué)的基礎(chǔ)上分析lncRNA靶基因功能，利用熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)桑椹花青素合成途徑中相關(guān)基因表達(dá)與花青素含量正相關(guān)。

3 桑樹Mul-UC3GT基因在花青素合成過程中的作用及其表達(dá)調(diào)控分析

3.1 克隆Mul-UC3GT基因測定同源度

以轉(zhuǎn)錄組提供的核苷酸序列為基礎(chǔ)，以桑椹cDNA為模板，以PCR技術(shù)為手段得到Mul-UC3GT克隆基因，并利用NCBI軟件對比同源蛋白質(zhì)中植物氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)Mul-UC3GT蛋白質(zhì)川桑的UGT蛋白質(zhì)所含有的氨基酸同源度高達(dá)98%，但與擬南芥序列所含有的氨基酸同源度僅僅只有29%，同時(shí)通過MEGA 5.0軟件構(gòu)建同源蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明川桑矢車菊素-3-O-葡萄糖苷-2-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶與Mul-UC3GT具備較近的親緣關(guān)系。

3.2 獲得轉(zhuǎn)Mul-UC3GT基因擬南芥

以Mul-UC3GT基因核苷酸序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異性引物并完成PCR擴(kuò)增完成其與克隆載體的連接轉(zhuǎn)化為感受態(tài)完成陽性克隆質(zhì)粒提取，以BamHI以及Sall為根本進(jìn)行陽性質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證，構(gòu)建Mul-UC3GT基因植物表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化為GV3101感受態(tài)細(xì)胞，完成對擬南芥野生型植株的浸染。對陽性植株進(jìn)行培養(yǎng)篩選，并進(jìn)行DNA模板提取和PCR擴(kuò)增，獲取轉(zhuǎn)Mul-UC3GT基因擬南芥，接下來完成RNA提取，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用熒光定量PCR分析驗(yàn)證轉(zhuǎn)Mul-UC3GT基因在轉(zhuǎn)Mul-UC3GT基因中的豐度。通過對轉(zhuǎn)基因植株與野生植株的對比發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株花青素含量更高[5]，表明Mul-UC3GT基因的桑椹花青素的合成過程中具備正調(diào)控作用。為驗(yàn)證該結(jié)論，特對野生植株與轉(zhuǎn)基因植株中的二氫黃酮醇-4-還原酶DFR以及無色花青素雙加氧酶LDOX表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株中二者的表達(dá)量更高，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)花青素修飾過程中的糖基化作用過程中的轉(zhuǎn)移酶明顯降低，證明了Mul-UC3GT基因的正調(diào)控作用。

4 Mul-CHS基因在花青素合成過程中的作用及其表達(dá)調(diào)控分析

4.1 克隆Mul-CHS基因完成同源化分析

整個(gè)過程同克隆Mul-UC3GT基因測定同源度一致，分析后發(fā)現(xiàn)Mul-CHS蛋白質(zhì)與川桑的CHS蛋白質(zhì)所含有的氨基酸同源度高達(dá)98%，與金絲桃、榴蓮等植物中的查爾酮合成酶CHS的同源性也高達(dá)90%以上，說明CHS具有較強(qiáng)的氨基酸序列保守性。通過MEGA 5.0軟件構(gòu)建同源蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹，表明Mul-CHS與川桑CHS具備較近的親緣關(guān)系。

4.2 獲得轉(zhuǎn)Mul-CHS基因擬南芥

同獲得轉(zhuǎn)Mul-UC3GT基因擬南芥過程，一致獲取轉(zhuǎn)Mul-CHS基因擬南芥。通過對轉(zhuǎn)基因植株與野生植株的對比發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株葉柄紫紅色較為明顯，而野生植株依舊為綠色，經(jīng)過一系列的測定表明轉(zhuǎn)基因植株花青素含量更高，表明Mul-CHS基因的桑椹花青素的合成過程中具備正調(diào)控作用。為驗(yàn)證該結(jié)論，特對查爾酮合成酶CHS在花青素合成上游催化過程中的基因表達(dá)量進(jìn)行分析，同時(shí)完成了對肉桂酸-4-羥化酶C4H以及肉桂酰輔酶A連接酶4CL基因表達(dá)量的判斷，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株中肉桂酸-4-羥化酶C4H以及肉桂酰輔酶A連接酶4CL表達(dá)量明顯降低，證明了Mul-CHS基因在花青素合成過程中的上游具備負(fù)調(diào)控作用、Mul-CHS基因在花青素合成過程中的下游具備正調(diào)控作用。

5 結(jié)語

經(jīng)過對植物花青素合成途徑的相關(guān)基因進(jìn)行研究分析發(fā)現(xiàn)，植物花青素合成的途中受到結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的影響，不同基因有著不同的功能。通過對桑椹中Mul-UC3GT、Mul-CHS基因的克隆以及轉(zhuǎn)基因的建立分析發(fā)現(xiàn)，二者對花青素的合成有著一定的調(diào)控作用。不過值得注意的是，無論是何種植物其花青素的合成皆是在諸多基因相互合作、相互關(guān)聯(lián)之下完成的，轉(zhuǎn)錄因子以及生長環(huán)境的影響也不容忽視，想要實(shí)現(xiàn)桑椹著色以及培育質(zhì)量的提升還需從基因工程入手。