元素分析-同位素質(zhì)譜法測定黃芪中碳、氮同位素比值及其在產(chǎn)地溯源中的應(yīng)用

明荔莉 范稚莉 王海燕 畢彬彬 唐梓意 李婉瑩

（拱北海關(guān)技術(shù)中心,廣東 珠海519000）

黃芪作為一味珍貴的中藥材,其藥用范圍廣泛,具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺、托毒生肌之功效[1]。近年來,黃芪在醫(yī)藥、保健、養(yǎng)生領(lǐng)域的藥用價(jià)值受到人們的重視,具有廣闊的開發(fā)前景。我國黃芪的產(chǎn)地主要集中在山西大同、內(nèi)蒙包頭、東北野生芪、甘肅隴西、山東萊陽、乳山等地[2]。不同產(chǎn)地的黃芪,其水土、氣候、日照、生物分布等生態(tài)因子差異很大,因而黃芪的生長特性具有一定的地域特征,其物理化學(xué)特點(diǎn)、產(chǎn)量和銷售價(jià)格有所不同,其藥效和品質(zhì)也具有明顯的地域差異[3]。長期的臨床醫(yī)療實(shí)踐表明,要保證中藥材的品質(zhì),須強(qiáng)調(diào)地道藥材開發(fā)和應(yīng)用,這對于保證中藥療效,起著十分重要的作用[4]。

常用的中藥材產(chǎn)地溯源技術(shù)有分子生物學(xué)[5,6]、指紋圖譜[7]、同位素示蹤[8]、無線射頻識別技術(shù)[9]和條形碼技術(shù)[10]。已有的研究表明,利用穩(wěn)定同位素指標(biāo)進(jìn)行產(chǎn)地溯源相比其他方法,具有分析速度快、精度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)勢[11]。同位素溯源技術(shù)的基本原理與依據(jù)是穩(wěn)定同位素的自然分餾效應(yīng),由于不同產(chǎn)區(qū)的大氣、土壤、水等環(huán)境中含有生源要素同位素組成具有差異,加之生物體內(nèi)的同位素組成受氣候、環(huán)境和生物代謝類型等因素的影響,不同地域來源的中藥材中同位素自然豐度存在差異[12]。因此,利用這種差異可以區(qū)分黃芪其可能的來源地區(qū)。

本項(xiàng)目利用穩(wěn)定同位素技術(shù),建立元素分析-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法（EA-IRMS）,測定不同產(chǎn)地黃芪樣品中碳、氮穩(wěn)定同位素比值（δ13C,δ15N）,通過統(tǒng)計(jì)分析,探討此方法在黃芪產(chǎn)地溯源中的應(yīng)用。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

DELTA V ADVANTAGE 同位素質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher 公司）,配備Flash 2000 HT 元素分析儀,ConFlo IV 萬用接口。氦氣（純度99．999%,載氣）、氧氣（純度99．999%,助燃?xì)猓⒍趸迹兌?9．99%,參考?xì)猓?、氮?dú)猓兌?9．99%,參考?xì)猓? mm×5 mm 錫杯；Milli-Q 超純水制備系統(tǒng)。尿素同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)IVA 33802174,咖啡因同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)IAEA-600。

1．2 樣品制備

來自4 個(gè)不同產(chǎn)地—山西大同、陜西子洲、甘肅隴西和內(nèi)蒙,共24 個(gè)黃芪樣品。樣品經(jīng)高速粉碎機(jī)磨碎、過篩后,保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 儀器條件

1．3．1 元素分析儀條件

燃燒管溫度（C、N 模式）:氧化還原爐溫度為980 ℃,GC 柱溫50 ℃,進(jìn)樣器氦氣載氣流速為110 mL/min,氧氣流速為175 mL/min,吹掃氣流速為200 mL/min。

1．3．2 ConFlo IV 條件

氦氣壓力為0．6 bar,CO2參考?xì)鈮毫?．0 bar,N2參考?xì)鈮毫?．0 bar。

1．3．3 質(zhì)譜條件

離子源電壓,2．9 KV；轟擊電壓,120．8eV；真空度,1．6 ×10-6mbar（針閥打開狀態(tài)下）。

1．4 碳、氮同位素測定

稱取約200 μg 粉末樣品,用錫杯包好后,經(jīng)氧化還原爐高溫氧化還原和GC 柱分離,樣品中的碳、氮元素轉(zhuǎn)化為純凈的CO2和N2氣體,再經(jīng)過ConFlo IV萬用接口對樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?進(jìn)入質(zhì)譜儀檢測。由于黃芪中碳、氮含量差異較大,通過調(diào)節(jié)樣品稀釋比,分別對碳、氮同位素比值進(jìn)行測定。

1．5 精度和準(zhǔn)確性測定

測定前,用已知δ13C 和δ15N 值的尿素和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對CO2和N2參考?xì)膺M(jìn)行標(biāo)定。樣品的測定精度用尿素同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來控制,每測定6個(gè)樣品測定一個(gè)質(zhì)控樣品,質(zhì)控樣品的重復(fù)分析標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0．3‰。每個(gè)黃芪樣品重復(fù)測定3 次,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差,考察方法測定實(shí)際樣品的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性。

1．6 數(shù)據(jù)處理

采用Thermo electronisodat version 3．0 軟件計(jì)算同位素值和獲取數(shù)據(jù)。采用SPSS19．0（美國,IBM）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Origin 9．0 繪圖軟件（美國Originlab 公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)圖繪制。

2 結(jié)果與討論

2．1 穩(wěn)定性

樣品分析前,運(yùn)行CO2、N2標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)怏w進(jìn)行onoff 測試,直至連續(xù)10 組參考?xì)怏w脈沖的δ13C、δ15N值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）分別小于0．06‰和0．3‰,才能進(jìn)行樣品測試。為了測試本方法對實(shí)際樣品分析的穩(wěn)定性,對每個(gè)黃芪樣品分別進(jìn)行3 次重復(fù)性分析,結(jié)果表明（見表1）,樣品δ13C、δ15N 值的SD 值均小于0．3‰,均在儀器分析允許誤差（0．3‰）范圍內(nèi),滿足穩(wěn)定性要求。

表1 不同產(chǎn)地黃芪樣品中δ13C、δ15N 值Tab．1 δ13C and δ15N values in Astragali Radix_among different regions

2．2 精度和準(zhǔn)確度

樣品的測定精度和準(zhǔn)確度,用實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控樣品來控制。重復(fù)10 次測定已知δ13C、δ15N 值的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),10 個(gè)質(zhì)控樣品δ13C、δ15N 值的SD 分別為0．053‰、0．115‰,表明EA-IRMS 法的精度能到達(dá)要求。

2．3 碳、氮穩(wěn)定同位素比值

不同產(chǎn)地黃芪中δ13C 和δ15N 值箱線圖結(jié)果見圖1。山西大同不同種植基地黃芪的δ13C 值接近,波動范圍在-26．770‰～-25．007‰之間；陜西子洲黃芪的δ13C 值波動范圍小,在-26．391‰～-26．039‰之間；內(nèi)蒙黃芪的δ13C 值范圍為-26．245‰～-25．092‰；甘肅隴西黃芪的δ13C 值范圍為-24．422‰～-22．780‰,相對其它產(chǎn)區(qū)其δ13C 值明顯偏負(fù)。

圖1 不同產(chǎn)地黃芪的δ13C、δ15N 值的箱線圖Fig．1 The boxplots of δ13C and δ15N values in Astragali Radix among different regions

山西大同不同種植基地黃芪的δ15N 值接近,波動范圍在-0．667‰～0．145‰之間；陜西子洲黃芪的δ15N 值波動范圍小,在-0．671‰～-0．263‰之間；甘肅隴西黃芪的δ15N 值范圍為-2．440‰～-0．187‰；內(nèi)蒙黃芪的δ15N 值范圍為-2．107‰ ～1．156‰。δ15N值是土壤氮來源、土地利用方式、耕作措施等的指示,同一地區(qū)不同樣品間變異較大[13]。甘肅隴西和內(nèi)蒙產(chǎn)地的黃芪樣品δ15N 值范圍波動較大,說明該地區(qū)在種植黃芪的土壤氮來源、土地利用方式或耕作措施上可能存在較大的地區(qū)性差異。

2．4 產(chǎn)地溯源分析

黃芪碳、氮穩(wěn)定同位素比值分析表明（見圖2）,甘肅隴西黃芪與其它3 個(gè)產(chǎn)地的δ13C 值均存在顯著性差異（p ＜0．002）,山西大同、陜西子洲和內(nèi)蒙產(chǎn)地黃芪的δ13C 值無顯著差異,但各產(chǎn)地黃芪的δ15N 值無顯著性差異。研究表明,δ13C 值的差異是產(chǎn)區(qū)溫度、有效水含量等環(huán)境因子的綜合反映,部分地區(qū)間差異不顯著[13]。甘肅隴西與其它產(chǎn)地黃芪中δ13C 值存在顯著差異,體現(xiàn)了甘肅隴西黃芪生長環(huán)境與其它產(chǎn)區(qū)存在明顯差異。甘肅隴西地區(qū)四季分明,日照充足,氣候溫和,年平均氣溫6．2 ℃,平均降水量445 mm,黃芪生長氣候高寒陰濕,土地肥沃疏松,具有黃芪生長獨(dú)特優(yōu)越的地理?xiàng)l件。利用穩(wěn)定碳同位素比值,甘肅隴西黃芪能夠有效地區(qū)分與其它產(chǎn)地,說明穩(wěn)定碳同位素可應(yīng)用于黃芪的產(chǎn)地溯源。

圖2 不同產(chǎn)地黃芪的δ13C 和δ15N 值Fig．2 δ13C and δ15N values in Astragali Radix among different regions

3 結(jié)論

EA-IRMS 法能夠快速測定黃芪中碳、氮穩(wěn)定同位素比值,測試結(jié)果準(zhǔn)確可靠,準(zhǔn)確度和精度均滿足要求。對山西大同、陜西子洲、甘肅隴西和內(nèi)蒙4 個(gè)不同產(chǎn)地的黃芪樣品的分析表明,利用穩(wěn)定碳同位素比值能將甘肅隴西黃芪與其它產(chǎn)地有效區(qū)分,說明穩(wěn)定碳同位素技術(shù)可應(yīng)用于黃芪的產(chǎn)地溯源。