黃芪多糖對脾虛濕困大鼠胃腸功能的調節(jié)及腸黏膜損傷修復的機制研究

楊彬彬 崔 寧 張亞楠 趙文曉 王世軍

1.山東中醫(yī)藥大學健康學院，山東濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，山東濟南 250355；3.山東中醫(yī)藥大學護理學院，山東濟南 250355

現(xiàn)代研究認為中醫(yī)“脾”是涉及消化吸收、能量轉化、水鹽代謝、內分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等的綜合功能單位，脾虛證主要表現(xiàn)為以消化系統(tǒng)為主的多系統(tǒng)多器官的功能低下。胃腸黏膜損傷是脾虛證常見病變之一，益氣健脾中藥對脾虛證患者胃腸道病變有改善作用。黃芪味甘，微溫；入脾、肺經(jīng)；補中益氣、固表利水、托膿毒和生肌[1]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃芪具有抗腫瘤、保護腸功能等作用[2]。黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）作為黃芪的主要化學成分之一，可以作用于人體多個系統(tǒng)，具有增強免疫系統(tǒng)功能、抗衰老、抗腫瘤、抗氧化等作用[3-4]。

Wnt 信號通路作為人體較為保守的信號途徑，對生命體的大多數(shù)生物學現(xiàn)象都有調控作用[5]，包含多種信號傳導途徑，Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）信號通路是Wnt 經(jīng)典途徑，已經(jīng)被證明與很多疾病的發(fā)生和發(fā)展相關，該信號通路激活后會促使人體包括腫瘤細胞在內的多細胞不斷增殖，形成增生性、炎癥性和腫瘤性病變。本實驗通過研究APS 調控Wnt 信號通路對大鼠腸道吸收功能及小腸黏膜損傷的影響，初步探討APS 修復腸道黏膜損傷機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar 雄性大鼠50 只，4 周齡，體重（150±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司購（實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，合格證號：1100111911015209）。SPF 級環(huán)境喂養(yǎng)。按照國家部屬實驗動物管理委員會制訂的標準飼養(yǎng)，并經(jīng)本單位實驗動物倫理委員會批準。動物房溫度23～25℃，相對濕度40%～50%，光照時間7∶00～19∶00。

1.2 藥物

APS，購于Solarbio 公司，批號：716D032，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑及儀器

大鼠淀粉酶酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked im munoadsordent assay，ELISA）試劑盒（批號：200107KE5）、大鼠胃泌素ELISA 試劑盒（批號：200107KE8）、大鼠胃動素ELISA 試劑盒（批號：200107KE9）、大鼠D-木糖ELISA 試劑盒（批號：200107KE10）、大鼠琥珀酸脫氫酶ELISA 試劑盒（批號：200107KE11）均購自江蘇晶美生物科技有限公司。Wnt1（貨號：PAB40578）、βcatenin 抗體（貨號：PAB30671）均購自Bioswamp 武漢貝茵萊生物科技有限公司；TG16W 微量高速離心機（湘儀集團）；GNP-9080 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏）；AC8 洗板機（芬蘭熱電）；352 型酶標儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS）。

1.4 研究方法

1.4.1 造模 大鼠適應性喂養(yǎng)3 d，按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、APS 高劑量組、APS 中劑量組、APS 低劑量組，每組10 只。除對照組（不作任何處理，正常飼養(yǎng)）外，其余各組按照前期本課題組模型制備方法造模，具體造模方法為：大鼠每日飼以高脂低蛋白飼料加力竭游泳，連續(xù)8 周，建立脾虛濕困大鼠模型[6]。對照組飼以AIN-76A 純化飼料。各組均自由進食、飲水。

1.4.2 給藥 造模成功后，于造模結束后次日APS 高劑量組按照900 mg/（kg·d）、APS 中劑量組按照600 mg/（kg·d）、APS 低劑量組按照300 mg/（kg·d）灌胃，1 次/d，每次1 ml/100 g，連續(xù)2 周，對照組和模型組給予同體積生理鹽水，灌胃。觀察大鼠一般狀況并記錄大鼠體重變化情況。

1.4.3 標本采集 各組大鼠麻醉后，腹主動脈采血，室溫靜置2 h 后低溫離心（4℃，3000 r/min，10 min，離心半徑10 cm），將血清放置于-20℃低溫冰箱中，備用。取小腸組織，置于4%多聚甲醛液中固定。

1.4.4 血清D-木糖、胃泌素、胃動素、琥珀酸脫氫酶、淀粉酶檢測 按照試劑盒說明，采用雙抗體夾心ELISA檢測各組大鼠血清淀粉酶、D-木糖、胃動素、胃泌素、琥珀酸脫氫酶水平。

1.4.5 小腸黏膜病理學及免疫組織化學檢測 小腸組織常規(guī)石蠟包埋，制作3～4 μm 石蠟切片，取各組大鼠小腸組織在10%中性甲醛中固定24 h 后進行脫水、透明處理，石蠟包埋，3～4 μm 切片，行常規(guī)HE 染色，于顯微鏡下觀察病理改變。

將包埋好的組織進行切片，厚度為3 μm；水浴展片，撈片，烤片，常規(guī)脫蠟水化；檸檬酸鈉緩沖溶液中高壓抗原修復；10%山羊血清中封閉；滴加Wnt1、βcatenin 一抗（1∶50 稀釋），4℃孵育過夜，次日放置室溫下復溫，滴加二抗（1∶50 稀釋），濕盒孵育，37℃孵育60 min。DAB 染色，蘇木精復染，樣本經(jīng)75%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ分別浸泡5 min 脫水，封片。在200 倍顯微鏡下觀察Wnt1、β-catenin 蛋白的表達，使用Mantra 圖像分析軟件對兩種目標蛋白進行光密度（optical density，OD）半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況

對照組一般狀況穩(wěn)定，進食正常，體重穩(wěn)定上升，活潑好動，大小便正常，毛色光澤。與對照組比較，模型組逐漸出現(xiàn)食欲不振、神倦懶動、瞇眼、被毛無光等狀況。

2.2 APS 對脾虛濕困大鼠血清淀粉酶、D-木糖水平的影響

與對照組比較，模型組血清淀粉酶、D-木糖水平顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）；與模型組比較，APS 高、中、低劑量組血清淀粉酶水平升高，APS 高劑量組D-木糖水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表1。

表1 APS 對脾虛濕困大鼠血清淀粉酶、D-木糖水平的影響（）

表1 APS 對脾虛濕困大鼠血清淀粉酶、D-木糖水平的影響（）

注：與對照組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。APS：黃芪多糖

2.3 APS 對脾虛濕困大鼠血清胃動素、胃泌素的影響

與對照組比較，模型組血清胃動素、胃泌素水平均顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。與模型組比較，APS 高劑量組血清胃泌素水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），APS 低劑量組、中劑量組血清胃動素水平顯著升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。見表2。

表2 APS 對脾虛濕困大鼠血清胃泌素、胃動素水平的影響（pg/ml，）

表2 APS 對脾虛濕困大鼠血清胃泌素、胃動素水平的影響（pg/ml，）

注：與對照組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。APS：黃芪多糖

2.4 APS 對脾虛濕困大鼠小腸黏膜病理形態(tài)學的影響

對照組小腸黏膜完整，絨毛表皮較完整，細胞排列整齊，黏膜層上皮細胞排列整齊，固有層內無或有少量炎癥細胞浸潤，間質未見明顯水腫，見圖1A。與對照組比較，模型組小腸絨毛排列紊亂、變短，表皮細胞出現(xiàn)明顯凋亡與壞死，固有層毛細血管擴張充血明顯，間質有少量中性粒細胞浸潤，見圖1B；與模型組比較，APS 各組小腸絨毛相對完整，細胞排列相對整齊，黏膜上層細胞排列相對整齊，固有層有少量炎癥細胞浸潤，間質未見明顯水腫，見圖1C～E。

圖1 APS 對脾虛濕困大鼠病理形態(tài)學影響（HE 染色，200×）

2.5 APS 對脾虛濕困大鼠小腸黏膜損傷相關蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組Wnt1、β-catenin 蛋白表達顯著升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。與模型組比較，APS 高、中、低劑量組Wnt1、β-catenin 蛋白水平均顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。見圖2～3，表3。

表3 APS 對脾虛濕困大鼠小腸黏膜蛋白Wnt1、β-catenin 水平影響（）

表3 APS 對脾虛濕困大鼠小腸黏膜蛋白Wnt1、β-catenin 水平影響（）

注：與對照組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。APS：黃芪多糖

圖2 APS 對脾虛濕困大鼠腸黏膜Wnt1 蛋白表達的影響（免疫組化，200×）

圖3 APS 對脾虛濕困大鼠腸黏膜β-catenin 蛋白表達的影響（免疫組化，200×）

3 討論

脾虛濕困是中醫(yī)常見證型，是主要以消化系統(tǒng)功能障礙為主的一種全身性綜合病理狀態(tài)[7-8]，大量研究表明脾虛證患者及動物易出現(xiàn)腸黏膜上皮細胞損傷及吸收障礙[9-10]。張介賓《類經(jīng)·藏象類》曰“小腸居胃之下，受盛胃中水谷而分清濁，水液由此而滲于前，糟粕由此而歸于后，脾氣化而上升，小腸化而下降”?？梢娢改c功能紊亂尤其是小腸的吸收功能下降在脾虛濕困發(fā)病機制中起到重要作用，而腸黏膜損傷導致通透性增高，引起腸道細菌和毒素移位，消化吸收功能下降，可能是脾虛濕困的發(fā)病機制。

黃芪性溫，補脾和胃，補氣生血，溫升，利水[11-12]。APS 作為其主要活性成分，具有保肝、降血糖、抗病毒、抗氧化延緩衰老等作用[13-18]，有研究顯示APS 可加速胃腸黏膜損傷早期修復過程[19]。

血清淀粉酶活性的強弱是消化酶分泌功能的特異性指標[20]。胃動素主要生理活性是誘發(fā)胃強烈收縮和小腸的分節(jié)運動，刺激胃蛋白酶和胰液的分泌[21]。本實驗中，APS 低、中劑量組血清淀粉酶及胃動素水平均較模型組升高，提示APS 能夠提高消化酶分泌，促進腸蠕動。胃泌素、D-木糖濃度可以間接反映脾氣虛證的嚴重程度及治療后的恢復情況[22]。本研究中，脾虛濕困大鼠血清胃泌素分泌減少、D-木糖水平下降，反映小腸吸收功能障礙，APS 干預后，APS 高劑量組胃泌素及D-木糖水平均較模型組顯著升高，提示APS 可以在一定程度上改善脾虛癥狀，使消化道黏膜得以修復，提高吸收功能。

Wnt 信號通路是在后生動物細胞內高度保守的關鍵信號通路，Wnt/β-catenin 信號通路是上世紀80 年代最先在動物研究中被發(fā)現(xiàn)[23]。其參與調控胚胎的早期發(fā)育、成體的組織穩(wěn)態(tài)維持、干細胞自我更新、細胞命運決定、細胞分裂及腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生物學過程[24-29]。

Wnt 通路的組成主要包括細胞外因子、跨膜受體Frizzled、β-catenin 及T 細胞趨化因子4 等一系列蛋白。Wnt/β-catenin 通路是Wnt 通路中最為經(jīng)典的信號通路。當Wnt/β-catenin 通路異常激活時，多種因子可與β-catenin 相互作用，使得β-catenin 由胞質轉移至核內，競爭性結合T 細胞趨化因子4，抑制T 細胞趨化因子4 的轉錄激活，從而誘導細胞發(fā)生增生性、炎癥性或者腫瘤性病變[30-31]。本實驗條件下，脾虛濕困大鼠小腸黏膜損傷、Wnt1、β-catenin 蛋白表達異常升高，APS 通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路，下調了Wnt1 及β-catenin 的表達，改善了腸黏膜損傷及胃腸功能，發(fā)揮其益氣健脾祛濕的功效。

本實驗對APS 高、中、低3 個劑量在提高脾虛濕困大鼠胃腸功能及修復腸道黏膜損傷機制方面進行深入研究。本實驗以前期研究為基礎，以大鼠血清淀粉酶、D-木糖、胃泌素、胃動素等指標變化反映脾虛濕困大鼠胃腸消化吸收功能的下降，小腸黏膜病理學形態(tài)結果及Wnt1、β-catenin 蛋白表達的變化提示這可能與腸黏膜損傷有關。APS 干預后，結果顯示腸黏膜損傷及胃腸功能紊亂得到一定程度改善，提示其機制可能與調節(jié)Wnt 信號通路有關。課題組將進一步就APS 如何通過Wnt 信號通路修復腸道黏膜損傷從而發(fā)揮健脾祛濕機制進行深入研究。