水稻稻瘟病抗性基因及稻瘟病菌無(wú)毒基因研究進(jìn)展

張麗麗，桑海旭，馬曉慧，毛 艇，闕補(bǔ)超，王紹林，張 戰(zhàn)，于深州，李春泉

（遼寧省鹽堿地利用研究所，遼寧 盤(pán)錦 124010）

水稻（Oryza sativa L.）是世界重要的糧食作物之一，也是我國(guó)重要口糧作物，水稻生產(chǎn)在確保我國(guó)糧食安全上具有重要地位，2017 年以來(lái)，我國(guó)每年水稻種植總面積達(dá)3 020 萬(wàn)hm2，產(chǎn)量達(dá)2億t 以上[1-3]。 稻瘟病是由子囊菌引發(fā)的水稻真菌病害，是水稻生產(chǎn)上最為重要的病害之一，每年可引起大幅度減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)甚至顆粒無(wú)收，對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)都造成嚴(yán)重影響[4-5]。 研究發(fā)現(xiàn)，近20 年稻瘟病病害呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)[6]。 近年來(lái)，我國(guó)水稻稻瘟病年平均危害面積在7 500 萬(wàn)hm2左右，每年因此損失的水稻產(chǎn)量高達(dá)數(shù)億公斤[7]。目前水稻生產(chǎn)中主要通過(guò)種植抗性品種和化學(xué)防治來(lái)降低稻瘟病的危害，但是化學(xué)防治方法費(fèi)用較高，且易對(duì)環(huán)境造成污染[8]。隨著水稻和稻瘟病病菌的基因測(cè)序工作的基本完成， 結(jié)合水稻與稻瘟病菌互作的基因?qū)蚣僬f(shuō)，關(guān)于稻瘟病抗性基因、稻瘟病菌無(wú)毒基因的研究取得顯著進(jìn)展， 為水稻抗稻瘟病分子標(biāo)記輔助育種、 基因工程育種及稻瘟病綠色防治提供了廣闊的前景。

1 水稻稻瘟病菌侵染機(jī)制

隨著分子技術(shù)快速發(fā)展， 國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)稻瘟病的侵染過(guò)程有了更深入了解， 其侵染路徑逐步清晰明了，尤其在分子水平上有關(guān)酶及蛋白的響應(yīng)、 植物激素防御反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑等方面，取得了大量研究成果[9-11]。 侵染過(guò)程主要分為兩個(gè)階段。

第一階段是在細(xì)胞外形成附著胞[12]。 分生孢子是由三個(gè)隔間細(xì)胞組成的結(jié)構(gòu)。 當(dāng)分生孢子附著在寄主表皮細(xì)胞上以后， 尖端的芽孢及它分泌的粘膠就會(huì)粘在植物細(xì)胞表面， 接著分生孢子利用本身細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在其頂端的細(xì)胞萌發(fā)形成極化的發(fā)芽管，這一步叫做“掛鉤”，是病菌對(duì)可侵染植株的識(shí)別階段[13]。 發(fā)芽管繼而特異性分化產(chǎn)生有黑色素的附著胞， 黑色素是很大一部分致病菌毒性的特征， 這些黑色素可以減少紫外線對(duì)病菌的傷害，或者作為一種毒性代謝物[14]。 同時(shí)發(fā)現(xiàn)只有在植物細(xì)胞疏水性的表面才可以產(chǎn)生附著胞， 且需要MAP 激酶、cAMP 應(yīng)答途徑以及植物幾丁質(zhì)的參與[15]，同時(shí)會(huì)發(fā)生分生孢子的自我吞噬現(xiàn)象，且容易受外界溫度的影響。

第二階段主要是涉及菌絲在植物細(xì)胞內(nèi)的形態(tài)發(fā)生。當(dāng)附著胞形成后，本身會(huì)由于甘油的累計(jì)而膨脹，最終會(huì)在附著胞的底部產(chǎn)生一個(gè)“侵入釘”，這個(gè)“侵入釘”內(nèi)部含有大量的微絲、微管，利用物理壓力穿透寄主組織的角質(zhì)層和表皮細(xì)胞壁[16]?！扒秩脶敗鼻秩爰?xì)胞內(nèi)后，首先在非原生質(zhì)體上分化為管狀的初始菌絲，最終形成胞內(nèi)侵入菌絲，這時(shí)的水稻細(xì)胞仍未被殺死，這種狀態(tài)叫做活體營(yíng)養(yǎng)[17]。 菌絲通過(guò)胞間連絲向周?chē)慕】导?xì)胞擴(kuò)散，直到水稻細(xì)胞死亡。當(dāng)病菌在水稻細(xì)胞內(nèi)大量繁殖時(shí)，它能調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)體系，使自身的繁殖不受制約， 同時(shí)產(chǎn)生大量有毒物質(zhì)毒害細(xì)胞。5～7 d 后， 就有大量的分生孢子涌出并作為新的感染源感染周?chē)闹仓辍?/p>

2 水稻稻瘟病抗性基因定位與克隆

2.1 稻瘟病抗性基因定位

20 世紀(jì)60 年代，日本學(xué)者最先開(kāi)展了稻瘟病抗性基因的研究， 并通過(guò)經(jīng)典遺傳分析法鑒定出了多個(gè)稻瘟病抗性基因。隨后，國(guó)際水稻研究所和中國(guó)等產(chǎn)稻國(guó)也逐漸開(kāi)展了相關(guān)研究， 大量的抗病基因不斷被鑒定。 國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用不同群體定位了多個(gè)抗稻瘟病基因， 例如Yu 等、Hayashi 等、Liu 等、Wang 等、Pan 等、Berruyer 等、Chen 等[18-24]。研究統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)被定位的抗性基因來(lái)源于不同的野生稻資源和品種[25]。 目前定位的抗性基因分布在11 條染色體上（3 號(hào)染色體除外），大部分集中在第6、11 和12 這3 條染色體上，在第11 染色體定位了Pi2、Pil、Pil8、Pi7、Pi44、Pik 等多個(gè)基因。 在12 號(hào)染 色體 上存 在1 個(gè) 由Pi4、Pi6、Pi20、Pi21、Pi31、Pi32、Pitq6、Pita 和Pita2 等多抗性基因組成的抗病基因簇，具有顯著的廣譜抗性[26-27]。 廣譜抗性基因Pi9 被定位在第6 條染色體短臂上， 它首次是從小粒野生稻導(dǎo)入栽培稻中被發(fā)現(xiàn)， 并對(duì)不同國(guó)家的43 個(gè)稻瘟病菌表現(xiàn)出高抗[28-29]。 Pi40 也是具有廣譜抗性的基因， 它對(duì)來(lái)自韓國(guó)和菲律賓的多個(gè)菌株表現(xiàn)出較高抗性[30]。 此外，Huang 等[31]利用抗性品種將Pi47 定位在第11 染色體，Deng等[32]定位了廣譜抗性的Pigm，對(duì)來(lái)自中國(guó)的9 個(gè)生理小種表現(xiàn)出明顯抗瘟性。

2.2 稻瘟病抗性基因克隆

截止到目前， 鑒定的抗稻瘟病基因已超過(guò)100 個(gè)，已克隆的36 個(gè)[33]，被分為四類(lèi)：①NBSLRR 類(lèi)蛋白， 例 如Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、Pi25、Pi35、Pi36、Pi37、Pi40、Pi56、Pi64、Pi-ta、Pib、Piz-t、Pikm、Pit、Pid3、Pish、Pik、Pik -p、Pia、Pigm、Pb1、Pi -CO39、Pi63、Pid3-A4、Pi54rh、Pi54of 和Pike 等29個(gè)抗性基因[27]。②RLK 類(lèi)蛋白，例如Pid2，它位于第6 號(hào)染色體，且有多個(gè)等位基因，克隆自水稻品種地谷，屬于組成型表達(dá)的單拷貝顯性基因。Pid2通過(guò)單個(gè)氨基酸差異區(qū)別抗感基因[34]。③富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域蛋白，例如Pi21。 Pi21 是一個(gè)隱性基因[35]，其編碼蛋白結(jié)構(gòu)域共有5 個(gè)富含脯氨酸的區(qū)域，它的抗性來(lái)源于蛋白功能的失活[36]。 ④富含ARM 重復(fù)序列蛋白，例如Ptr。 Ptr 編碼一個(gè)非典型的廣譜抗性蛋白, 包含4 個(gè)Armadillo 重復(fù)區(qū)，Ptr 的抗性與Pita 和Pita2 有關(guān)， 研究還發(fā)現(xiàn)，該基因是單子葉植物所特有的[37]。 ⑤TPRs 類(lèi)蛋白，例如Bsr-k1，該基因具有對(duì)稻瘟病和白葉枯病雙重抗性，主要原因是Bsr-k1 功能喪失，同時(shí)它還是一個(gè)具有廣譜抗性的隱性基因[38]。

3 稻瘟病菌無(wú)毒基因

水稻與稻瘟病菌之間的特異互作關(guān)系符合經(jīng)典的基因?qū)驅(qū)W說(shuō)[39]。 無(wú)毒基因（AVR）是一類(lèi)能夠誘發(fā)植物產(chǎn)生抗病性的病原物遺傳因子，在稻瘟菌與水稻互作中， 無(wú)毒基因的作用是轉(zhuǎn)錄翻譯成無(wú)毒蛋白質(zhì)，然后被水稻細(xì)胞內(nèi)的R 基因識(shí)別進(jìn)而產(chǎn)生抗性[40]。 目前已鑒定且與抗性基因相對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因共24 個(gè)，12 個(gè)基因被克隆。 例如Avr-Pita、ACE1、Avr-Pizt、Avr-Pia、Avr-Pii、Avr-Pik/km/kp、PWL1、PWL2、Avr-Pi9 等，其中只有前兩種基因不參與編碼分泌蛋白[41-42]。 目前，Pi-ta、Piz-t、Pik、Pia、Pi-CO39、Pi54、Pii、Pi9 和Pib 等抗性基因相對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因已被克隆， 而且絕大多數(shù)抗性—無(wú)毒蛋白分子互作關(guān)系已明晰， 分直接互作和間接互作兩類(lèi)。 其中直接互作包括：①抗病蛋白和無(wú)毒蛋白的一一對(duì)應(yīng)。 例如Pi-ta 與AVR-Pita 和Pi54 與AVR-Pi54， 其中Pi-ta 與AVR-Pita 間的互作跟抗性蛋白Pi-ta 的LRR 結(jié)構(gòu)域變化有關(guān)，二者均為直接互作，差異在于Pita 的防御應(yīng)答條件[42-43]。 ②兩種抗性蛋白對(duì)應(yīng)一個(gè)無(wú)毒基因。 例如Pik，研究表明Pik 由兩個(gè)蛋白組成（Pik-1 和Pik-2），Pik-1 可跟AVR-Pik 直接互作， 但Pik-2 不能獨(dú)自作為AVR-Pik 的受體，必須以復(fù)合體的形式才能參與防御反應(yīng)[44]。 值得關(guān)注的是， 抗病基因Pik 和無(wú)毒基因的AVR-Pik各自都有不同數(shù)量的等位基因， 而且不同抗病基因和無(wú)毒基因間可相互識(shí)別， 表明抗性基因和無(wú)毒基因間等位基因的相伴存在， 闡明抗病基因與無(wú)毒基因之間的協(xié)同進(jìn)化機(jī)制。③成對(duì)的抗病蛋白跟多個(gè)無(wú)毒基因互作。例如Pia，Pia 的兩個(gè)成員RGA4 和RGA5， 二者在參與調(diào)控防御反應(yīng)時(shí)，只有RGA5-A 與AVR-Pia 或AVR1-CO39 互作，且RGA5 中RATX1 域在與無(wú)毒基因作用時(shí)發(fā)揮重要作用[45]。

4 展望

目前，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，水稻抗性基因鑒定、 克隆及水稻—稻瘟病互作機(jī)制的研究取得了顯著進(jìn)展。截止目前，鑒定和克隆了大量的抗性基因和無(wú)毒基因， 并對(duì)二者間的互作機(jī)制進(jìn)行了深入解析， 這些基因?yàn)榭沟疚敛∮N提供了新思路和新材料。 很多研究者把已知抗性基因運(yùn)用到抗稻瘟病育種實(shí)踐中， 并獲得了一批具有廣譜抗性又高產(chǎn)的水稻新材料， 已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛利用[46-48]。 由于水稻與稻瘟病菌之間存在著極其復(fù)雜的互作關(guān)系， 稻瘟病菌侵害促進(jìn)了水稻抗性基因的進(jìn)化與形成， 而外界自然因素的影響又迫使稻瘟病菌不斷突變以應(yīng)對(duì)水稻的防御，同時(shí)大量抗性基因也未得到充分利用，目前的研究，也只是冰山一角， 為了進(jìn)一步解析水稻與稻瘟病菌的互作機(jī)理， 更加高效地利用抗性基因?yàn)榈疚敛】共∮N服務(wù)， 以下幾方面還需要開(kāi)展進(jìn)一步研究：①繼續(xù)開(kāi)展抗性基因與無(wú)毒基因互作的分子機(jī)理研究， 探明二者互作的下游信號(hào)途徑。 ②繼續(xù)解析水稻廣譜抗性基因的分子機(jī)理， 為基因的利用提供理論依據(jù)。 ③開(kāi)發(fā)更有效、與抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記， 促進(jìn)抗性基因在育種中的利用，提高育種分子化水平。 ④挖掘抗稻瘟病種質(zhì)資源，發(fā)掘新的抗稻瘟病基因。充分利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)、 轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)等作物育種技術(shù)，簡(jiǎn)化育種程序，提升育種效率，獲得更多的廣譜抗性新品種， 切實(shí)提高我國(guó)的稻瘟病綠色防控水平。