沙利度胺對(duì)阿爾茨海默病秀麗隱桿線蟲模型的改善作用及機(jī)制

方亞影 閻茹玉 李玉賢 吳宿慧 李寒冰 李根林

關(guān)鍵詞沙利度胺;秀麗隱桿線蟲;阿爾茨海默病;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種常見(jiàn)的漸行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，患者大腦中普遍呈現(xiàn)腦組織萎縮、老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)等病理特征[1]。全球AD患者正逐年遞增，目前臨床上也缺乏能有效治療AD的藥物[2]。

沙利度胺是一種新型的免疫調(diào)節(jié)藥和抗炎藥，可抑制單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α（tumornecrosis factor-α，TNF-α），從而減少淀粉樣蛋白的形成;其還能抑制白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生[3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，上述炎癥因子可參與Tau 蛋白的過(guò)度磷酸化，加快Tau 蛋白病理形成的過(guò)程[4-5]。

Tau 蛋白的病理變化與AD患者認(rèn)知能力下降有較強(qiáng)的相關(guān)性。Tau 蛋白的正常生理功能是與微管蛋白結(jié)合，以維持細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性[6]。糖原合成激酶3β（glycogensynthase kinase 3β，GSK-3β）是磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（proteinkinase B，Akt）的下游底物，其活化后可導(dǎo)致Tau 蛋白過(guò)度磷酸化，從而使Tau 蛋白大量沉積并形成纏結(jié)，進(jìn)而破壞神經(jīng)元的生理功能[7 - 8]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/Akt途徑可改善神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[9]。

秀麗隱桿線蟲（以下簡(jiǎn)稱“線蟲”）因其生命周期短、神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遺傳信息清晰和易于獲得大量個(gè)體模型等優(yōu)點(diǎn)，常被用于神經(jīng)退行性疾病的相關(guān)研究[10]。

BR5270 品系線蟲體內(nèi)可表達(dá)人源Tau 蛋白，具有加速Tau 蛋白聚集的特點(diǎn)，使其從成年第1 天起就出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元功能障礙;BR5271 品系線蟲體內(nèi)表現(xiàn)出抗Tau蛋白聚集的特點(diǎn)，常作為BR5270 品系線蟲的對(duì)照[11]。

另外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，線蟲體內(nèi)PI3K和Akt 的同源基因是Age-1 和Akt-1[12-13]?；诖?，本研究以BR5270 品系線蟲為AD模型，研究沙利度胺改善線蟲體內(nèi)Tau 蛋白毒性及提高線蟲學(xué)習(xí)記憶能力的作用及機(jī)制，以期為沙利度胺治療AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有HVE-50 型高壓蒸汽滅菌鍋（日本Hirayama 公司），DL-CJ-2ND Ⅰ型潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），LY03-200 型生化培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司），Nano Drop One C2000 型超微量紫外分光光度計(jì)、Fresco 21 型低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），Quant Studio 7Flex 型逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國(guó)AppliedBiosystems 公司），Gel Doc XR+型自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有沙利度胺片（常州制藥廠有限公司，批號(hào)19031332，規(guī)格50 mg/片），二甲基亞砜（DMSO，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)20210415），蛋白胨、瓊脂粉（北京奧博星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為20190126、20191030），酵母浸粉（美國(guó)Oxoid 公司，批號(hào)分別為1267856-03），Trizol 試劑（美國(guó)Ambion Life 公司，批號(hào)204202），TB GreenTM Premix ExTaqTM Ⅱ、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（日本Takara 公司，批號(hào)分別為RR820A、RR047A）。Gsk-3、Age-1、Akt-1、Clp-1 基因（鈣蛋白酶的同源基因）的引物由深圳華大基因科技有限公司設(shè)計(jì)并合成（PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1）。其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動(dòng)物

線蟲（品系包括BR5270、BR5271）均購(gòu)自美國(guó)線蟲中心（https：//cgc.umn.edu），大腸埃希菌Escherichia coliOP50 尿嘧啶合成缺陷菌株由北京生命科學(xué)研究所董夢(mèng)秋教授課題組惠贈(zèng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 線蟲的培養(yǎng)及同期化處理

2.1.1 NGM培養(yǎng)基的制備稱取氯化鈉0.60 g、蛋白胨0.50 g、瓊脂粉3.40 g，加入5 mg/mL 膽固醇溶液200 μL和純水200 mL，經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121 ℃，15 min）后，依次加入濃度均為1 mol/L 的MgSO4溶液和CaCl2溶液各200 μL、1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）5 mL，搖勻后倒板，加入100 μL 大腸埃希菌溶液（由于線蟲以大腸埃希菌為食，故后續(xù)將其稱為“食物”）涂布均勻，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～12 h，備用。

2.1.2 線蟲的同期化處理將2 種線蟲（BR5270、BR5271 品系）置于含有食物的NGM 培養(yǎng)基上培養(yǎng)（16 ℃條件下）。挑取處于產(chǎn)卵期的線蟲于含有食物的NGM培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4 h 后，移除線蟲，保留蟲卵;繼續(xù)孵育蟲卵至產(chǎn)卵期，即得同期化的親代線蟲，再將親代線蟲繼續(xù)培養(yǎng)至產(chǎn)卵期，保留蟲卵，即得同時(shí)期的蟲卵[14]。

2.2 沙利度胺對(duì)BR5270品系線蟲的毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)

取BR5270 品系線蟲，按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行同期化處理后，分為溶劑對(duì)照組（1%DMSO）和沙利度胺不同質(zhì)量濃度組（10、25、50、100 mg/mL），每組20 條，并設(shè)個(gè)平行。將線蟲置于含不同藥物的NGM培養(yǎng)基（含食物）上，于16 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h 后，記錄各組線蟲的死亡數(shù)量。結(jié)果顯示，溶劑對(duì)照組和沙利度胺10mg/mL組線蟲無(wú)死亡;當(dāng)沙利度胺給藥質(zhì)量濃度增加至25 mg/mL 時(shí)開(kāi)始有線蟲死亡，死亡數(shù)為（1.67±0.58）條;沙利度胺給藥質(zhì)量濃度為50、100 mg/mL時(shí)，線蟲死亡數(shù)分別為（5.00±1.00）、（17.34±2.52）條。這提示沙利度胺對(duì)線蟲的毒性隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。因此，為了避免線蟲毒理學(xué)特征的出現(xiàn)，本研究將沙利度胺最大給藥質(zhì)量濃度定為15 mg/mL。

2.3 BR5270 品系線蟲的基礎(chǔ)慢反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

BR5270 品系線蟲由于Tau 蛋白的聚集，表現(xiàn)為從成年第1 天開(kāi)始就運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突缺損[11]，因此，通過(guò)測(cè)定線蟲的擺動(dòng)次數(shù)，可探究沙利度胺對(duì)BR5270 品系線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響。按“2.1.2”項(xiàng)下方法將BR5271、BR5270 品系線蟲進(jìn)行同期化處理，然后于16 ℃條件下培養(yǎng)24 h 后，將BR5271 品系線蟲作為對(duì)照組，BR5270 品系線蟲分為空白組（不加藥物）和沙利度胺不同質(zhì)量濃度組（0.5、2.0、6.0、15.0 mg/mL），每組30條，并設(shè)3 個(gè)平行。將線蟲置于含不同藥物的NGM培養(yǎng)基（含食物）上，于16 ℃條件下培養(yǎng)至成年（培養(yǎng)5 d）后，測(cè)定各組線蟲30 s 內(nèi)的擺動(dòng)次數(shù)[15]。采用GraphPadPrism 8.0.2 統(tǒng)計(jì)軟件作圖，以SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果用x±s 表示;多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)（方差齊時(shí)）或Dunnett’s T3 多重比較（方差不齊），檢驗(yàn)水平α=0.05（下同）。結(jié)果顯示，與空白組比較，對(duì)照組與沙利度胺2.0、6.0、15.0 mg/mL組線蟲在30 s 內(nèi)的擺動(dòng)次數(shù)均顯著增加（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 BR5270 品系線蟲的壽命實(shí)驗(yàn)

BR5270 品系線蟲由于Tau 蛋白聚集，其生存時(shí)間比BR5271 品系線蟲短[11]，10%最大壽命可反映藥物對(duì)線蟲生存時(shí)間的影響[16]，因此，通過(guò)分析線蟲的10%最大壽命和生存率曲線，可探討沙利度胺是否能延長(zhǎng)BR5270品系線蟲的壽命。按“2.3”項(xiàng)下方法將BR5271、BR5270品系線蟲進(jìn)行同期化處理及分組、給藥，并設(shè)3 個(gè)平行，于16 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每隔24 h 觀察線蟲的生存狀態(tài)，并記錄線蟲的死亡數(shù)量，直至各組線蟲全部死亡，計(jì)算各組線蟲10%最大壽命[15]。線蟲死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)：將線蟲拾取器用酒精燈燒熱后，輕觸線蟲并觀察線蟲是否有反應(yīng)，如果沒(méi)有反應(yīng)則判斷為死亡[16]。結(jié)果顯示，與空白組比較，對(duì)照組和沙利度胺0.5 mg/mL 組線蟲的10%最大壽命顯著延長(zhǎng)（P<0.01），且兩者的生存率曲線也整體高于空白組;沙利度胺其余各組的10%最大壽命差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥周期比壽命實(shí)驗(yàn)短，故將沙利度胺給藥質(zhì)量濃度設(shè)置為0.5、2.0、6.0mg/mL。結(jié)果見(jiàn)表3、圖1。

2.5 BR5270 品系線蟲的短期學(xué)習(xí)記憶能力實(shí)驗(yàn)

BR5270 品系線蟲的學(xué)習(xí)指數(shù)與短期學(xué)習(xí)記憶能力呈正相關(guān)，因此，通過(guò)測(cè)定各組BR5270 品系線蟲的學(xué)習(xí)指數(shù)，可探究沙利度胺是否能改善BR5270 品系線蟲的短期學(xué)習(xí)記憶能力[17]。按“2.1.2”項(xiàng)下方法將BR5270 品系線蟲進(jìn)行同期化處理，然后將蟲卵于16 ℃培養(yǎng)4 d后，分為空白組、溶劑對(duì)照組（1%DMSO）、沙利度胺不同質(zhì)量濃度組（0.5、2.0、6.0 mg/mL），每組800 條，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，各組取200 條線蟲置于不含食物的NGM培養(yǎng)基上進(jìn)行趨化性測(cè)試（趨化性測(cè)定板制備如圖2 所示），記錄每組線蟲訓(xùn)練前的趨化指數(shù)（CINaive）[17]。將各組剩余線蟲進(jìn)行短期學(xué)習(xí)記憶丁酮訓(xùn)練（如圖3 所示），再轉(zhuǎn)移至含有食物的NGM固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、0.5、1.5 h 時(shí)，每組各取200 條線蟲進(jìn)行趨化性測(cè)試，并記錄各時(shí)間點(diǎn)的趨化指數(shù)（CI0 h、CI0.5 h、CI1.5 h），再計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的學(xué)習(xí)指數(shù)[學(xué)習(xí)指數(shù)=CI0 h-CINaive（或CI0.5 h-CINaive，或CI1.5 h-CINaive）]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次[18]。結(jié)果顯示，與空白組比較，沙利度胺6.0 mg/mL 組線蟲的短期學(xué)習(xí)指數(shù)在培養(yǎng)0、0.5、1.5 h 時(shí)均顯著升高（P<0.01）;其余給藥組該指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表4、圖4。

2.6 BR5270 品系線蟲長(zhǎng)期學(xué)習(xí)記憶能力實(shí)驗(yàn)

將BR5270 品系線蟲按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行同期化處理和分組（每組1 000 條），培養(yǎng)48 h 后，各組取200 條線蟲置于不含食物的NGM培養(yǎng)基上進(jìn)行趨化性測(cè)試（每組平行3 個(gè)平板），記錄每組線蟲訓(xùn)練前的趨化指數(shù)（CINaive）。將各組剩余線蟲進(jìn)行長(zhǎng)期學(xué)習(xí)記憶能力丁酮訓(xùn)練（如圖5 所示）[17]。最后一次訓(xùn)練完成后，將線蟲轉(zhuǎn)移至含食物的NGM培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、16、24、40 h 時(shí)，每組取200 條線蟲進(jìn)行趨化性測(cè)試，并記錄各時(shí)間點(diǎn)的趨化指數(shù)（CI0 h、CI16 h、CI24 h、CI40 h），再按“2.5”項(xiàng)下公式計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的學(xué)習(xí)指數(shù)。結(jié)果顯示，與空白組比較，沙利度胺6.0 mg/mL 組線蟲的長(zhǎng)期學(xué)習(xí)指數(shù)在培養(yǎng)0、16 h 時(shí)均顯著升高（P<0.01）;其余給藥組該指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表5、圖6。

2.7 BR5270 品系線蟲體內(nèi)Gsk-3、Age-1、Akt-1、Clp-1基因mRNA的表達(dá)水平檢測(cè)

將BR5270 品系線蟲按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行同期化處理和分組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，采用低溫Trizol 法提取各組線蟲的總RNA，再按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA 為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為：cDNA 模板1 μL，TB GreenTMPremix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，RNase free water 7 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃變性30 s;95 ℃變性15 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以actin-1 基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Gsk-3、Age-1、Akt-1、Clp-1 基因mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果顯示，與空白組比較，沙利度胺各質(zhì)量濃度組線蟲體內(nèi)Age-1、Akt-1 基因（沙利度胺0.5、2.0 mg/mL 組除外）的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05 或P<0.01），Gsk-3（沙利度胺0.5 mg/mL組除外）、Clp-1 基因的mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05 或P<0.01），結(jié)果見(jiàn)表6。

3 討論

本研究使用的BR5270 品系線蟲屬于Tau 轉(zhuǎn)基因線蟲模型，人源Tau 蛋白聚集片段由于K280 基因的缺失增強(qiáng)了Tau 蛋白的聚集傾向，使該品系線蟲的毒性急劇增加，表現(xiàn)為從成年第1 天開(kāi)始就運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)、軸突缺損、運(yùn)動(dòng)能力嚴(yán)重受損等[11]。BR5271 品系線蟲由于具有抗Tau 蛋白聚集的特點(diǎn)，常作為BR5270 品系線蟲的對(duì)照組[11]。本研究的基礎(chǔ)慢反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沙利度胺可以明顯增加BR5270 品系線蟲的擺動(dòng)次數(shù)，這提示其可改善線蟲因Tau 蛋白聚集而導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)能力受損。壽命實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低劑量（0.5 mg/mL）的沙利度胺可顯著延長(zhǎng)BR5270 品系線蟲的10%最大壽命，這提示沙利度胺能較好地緩解該品系線蟲因Tau 蛋白聚集而導(dǎo)致的毒性作用。

丁酮是一種帶有氣味的揮發(fā)性物質(zhì)，在缺乏食物時(shí)，給予線蟲食物并將其暴露于丁酮?dú)馕吨?，線蟲會(huì)根據(jù)丁酮?dú)馕秾ふ沂澄铮虼丝蓪⑵溆脕?lái)研究線蟲的學(xué)習(xí)記憶能力[18]。一般情況下，對(duì)線蟲進(jìn)行長(zhǎng)期記憶訓(xùn)練的持續(xù)時(shí)間應(yīng)大于16 h，短期記憶訓(xùn)練的持續(xù)時(shí)間則應(yīng)小于2 h[19-20]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)沙利度胺（6.0 mg/mL）干預(yù)后，BR5270 品系線蟲短期學(xué)習(xí)指數(shù)和長(zhǎng)期學(xué)習(xí)指數(shù)（培養(yǎng)0、16 h 時(shí)）均顯著升高，長(zhǎng)期學(xué)習(xí)指數(shù)（24、40 h）與空白組相比有升高，但無(wú)顯著性差異，這可能與長(zhǎng)期學(xué)習(xí)記憶能力從培養(yǎng)16 h 后開(kāi)始下降有關(guān)，與Amano等[20]的研究結(jié)論一致。這提示沙利度胺可改善BR5270品系線蟲短期和長(zhǎng)期的學(xué)習(xí)記憶能力。

過(guò)度磷酸化的Tau 蛋白與微管脫離后，可積累形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)，從而造成突觸結(jié)構(gòu)的可塑性損傷以及神經(jīng)元的變性和凋亡，進(jìn)而引發(fā)AD[21]。GSK-3β是誘導(dǎo)Tau 蛋白磷酸化的主要蛋白激酶，其在線蟲體內(nèi)的同源基因?yàn)镚sk-3[22]。在PI3K/Akt 信號(hào)通路中，PI3K（線蟲體內(nèi)的同源基因?yàn)锳ge-1）被激活后可活化Akt（線蟲體內(nèi)的同源基因?yàn)锳kt-1）的功能，活化后的Akt 又可抑制GSK-3β的活性，進(jìn)而減少Tau 蛋白的異常磷酸化[23]。本研究結(jié)果顯示，沙利度胺可顯著升高BR5270 品系線蟲體內(nèi)Age-1、Akt-1 基因（0.5、2.0 mg/mL 的沙利度胺除外）mRNA表達(dá)水平，顯著降低Gsk-3 基因mRNA表達(dá)水平（0.5 mg/mL 的沙利度胺除外），這提示沙利度胺可能是通過(guò)活化PI3K/Akt 信號(hào)通路來(lái)減少Tau 蛋白的異常磷酸化。另外有研究發(fā)現(xiàn)，Tau 蛋白與突觸后致密蛋白95（postsynaptic density-95，PSD-95）相互作用后，可使Ca2 +通過(guò)N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acidreceptor，NMDA）受體大量流入細(xì)胞，從而激活鈣蛋白酶并引發(fā)線粒體功能障礙，最終誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[24]。在線蟲體內(nèi)鈣蛋白酶的同源基因是Clp-1[25]。本研究結(jié)果顯示，沙利度胺可顯著降低BR5270 品系線蟲體內(nèi)Clp-1 基因mRNA表達(dá)水平，這提示沙利度胺可能是通過(guò)抑制鈣蛋白酶來(lái)減輕Tau蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，沙利度胺可改善AD線蟲模型的運(yùn)動(dòng)障礙，并延長(zhǎng)其壽命，增強(qiáng)其學(xué)習(xí)記憶能力;具體作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt 信號(hào)通路和抑制蛋白酶有關(guān)。本研究結(jié)果也初步證實(shí)沙利度胺抗AD的作用，可為沙利度胺治療AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。