玉米醇溶蛋白-殼聚糖納米營(yíng)養(yǎng)遞送粒子的制備及性質(zhì)

李書紅，周軍君，陳桂蕓，秦邵爽，李赫宇，陳 野

玉米醇溶蛋白-殼聚糖納米營(yíng)養(yǎng)遞送粒子的制備及性質(zhì)

李書紅1，周軍君1，陳桂蕓1，秦邵爽1，李赫宇2，陳 野1※

（1. 天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，國(guó)家食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2. 天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津 300457）

利用蛋白質(zhì)和多糖構(gòu)建納米營(yíng)養(yǎng)遞送載體，是提高食品活性物質(zhì)穩(wěn)定性及利用率的重要手段。為了構(gòu)建具有緩釋特性的納米營(yíng)養(yǎng)遞送體系，該研究以玉米醇溶蛋白（zein）為基材，構(gòu)建玉米醇溶蛋白-殼聚糖納米營(yíng)養(yǎng)遞送體系，以姜黃素（Curcumin，Cur）為營(yíng)養(yǎng)模型，探究了殼聚糖分子量、zein與殼聚糖質(zhì)量比對(duì)納米粒子及其負(fù)載Cur性能的影響，通過掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）、傅里葉紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR）等方法表征其結(jié)構(gòu)，闡明復(fù)合納米粒子形成機(jī)制，探討其穩(wěn)定性和緩釋性能。結(jié)果表明：不同分子量的殼聚糖對(duì)納米粒子的粒徑、多分散性指數(shù)和zeta電位有影響。高分子量殼聚糖的加入可使納米粒子粒徑減小，且更加穩(wěn)定。在zein與高分子量殼聚糖質(zhì)量比為8∶1時(shí)，制備的納米粒子粒徑較小（80.13 nm），其zeta電位為46.18 mV；在此條件下，當(dāng)姜黃素添加量為1.0%時(shí)，其包封率和負(fù)載量分別為82.93%和8.29%；通過SEM觀察，納米粒子呈球形，分布均勻；氫鍵及靜電相互作用是組裝該納米粒子的作用力；殼聚糖的引入提高了納米粒子的pH值、離子及儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍；與游離的姜黃素相比，納米營(yíng)養(yǎng)遞送粒子呈現(xiàn)明顯的緩釋特性。研究結(jié)果為構(gòu)建具有緩釋特性的營(yíng)養(yǎng)遞送體系提供了理論基礎(chǔ)。

營(yíng)養(yǎng)；模型；玉米醇溶蛋白；殼聚糖；納米粒子；緩釋性能

0 引 言

隨著消費(fèi)者健康意識(shí)的增強(qiáng)，食品中的許多活性物質(zhì)受到廣泛關(guān)注。然而，部分活性物質(zhì)存在水溶性差、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定和代謝速率高等問題，限制了食源性活性物質(zhì)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展，對(duì)食品工業(yè)和消費(fèi)者都產(chǎn)生了巨大影響。利用蛋白質(zhì)和多糖構(gòu)建納米營(yíng)養(yǎng)遞送載體，是提高食品活性物質(zhì)穩(wěn)定性及利用率的重要手段。納米營(yíng)養(yǎng)遞送載體是一種直徑小于1 000 nm、可以輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的納米體系，主要包含納米粒子、納米乳液、膠束、水凝膠、脂質(zhì)體和納米聚合物等類型[1]，納米營(yíng)養(yǎng)遞送體系與其他營(yíng)養(yǎng)遞送系統(tǒng)相比具有巨大的優(yōu)勢(shì)：1） 具有尺寸效應(yīng)和體內(nèi)分布特異性。納米載體體積更加微小，能夠直接作用于體內(nèi)某些蛋白質(zhì)和細(xì)胞，控制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的釋放位置，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物利用率[2]。2） 具有緩釋效果，改善胃腸道吸收。通過設(shè)計(jì)納米遞送體系的結(jié)構(gòu)，可控制營(yíng)養(yǎng)成分的釋放速度，滿足人體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的持續(xù)需求[3]。3）可以增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的透過性，進(jìn)而充分發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)成分的功能活性[4]。目前，研究報(bào)道的納米營(yíng)養(yǎng)遞送體系存在包封率和負(fù)載量較低、突釋現(xiàn)象顯著等問題[5]，這限制了納米營(yíng)養(yǎng)遞送載體的實(shí)際應(yīng)用。

玉米醇溶蛋白（zein）含有大量的疏水性氨基酸，且缺少帶電的氨基酸，該組成導(dǎo)致其不溶于水、無水醇類，而可溶于醇-水溶液、強(qiáng)堿、丙二醇以及多種有機(jī)溶劑混合液[6]。Liu等[7]通過小角度X-衍射研究zein的單元結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，1個(gè)zein含有9個(gè)同系物的重復(fù)單位，以氫鍵形成反平行結(jié)構(gòu)。zein在自組裝特性方面表現(xiàn)突出，溶劑極性變化能夠誘導(dǎo)zein分子構(gòu)象發(fā)生改變，最終形成納米球形粒子。因?yàn)楠?dú)特的分子結(jié)構(gòu)及自組裝特性，zein成為制備納米粒子的理想材料。由于zein的等電點(diǎn)在6.2左右，zein納米粒子在中性條件下不穩(wěn)定并會(huì)發(fā)生聚集。此外，zein納米粒子在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中會(huì)出現(xiàn)大量沉淀，干燥后無法復(fù)溶。解決這一問題的主要方法就是在制備zein納米粒子的過程中加入多糖、脂類及其他蛋白作為穩(wěn)定劑，阻止其在外界條件變化時(shí)的進(jìn)一步聚集[8]。

殼聚糖（chitosan，CS）為天然高分子，來源豐富，價(jià)格低廉，其分子結(jié)構(gòu)獨(dú)特，具有無毒、抑菌性、生物相容性和可降解等優(yōu)點(diǎn)，并且具有良好的成膜性。有研究表明，CS是zein納米粒子優(yōu)良的穩(wěn)定劑，可提供空間位阻作用及靜電穩(wěn)定效應(yīng)，有效防止zein在中性條件及干燥后的聚集[9]。Chen等[10-11]報(bào)道，CS載體不僅能夠吸附在特定組織表面，而且可以延長(zhǎng)載體在某一特定位置的停留時(shí)間，通過包埋物和粘膜的緊密接觸來增加物質(zhì)在該位置的有效濃度。

近年來，關(guān)于蛋白多糖營(yíng)養(yǎng)遞送體系的研究多集中在蛋白濃度、多糖種類、蛋白與多糖比例等對(duì)納米粒子性質(zhì)的影響。Hu等[12]發(fā)現(xiàn)添加果膠的玉米醇溶蛋白納米粒子之間通過空間位阻作用和靜電排斥作用來提高粒子穩(wěn)定性。Chang等[13]研究了玉米醇溶蛋白和三種多糖（果膠、羧甲基纖維素和阿拉伯膠）制備的蛋白質(zhì)多糖復(fù)合物納米粒子的交聯(lián)效率。研究發(fā)現(xiàn)，果膠和羧甲基纖維素更有利于形成粒徑更小，包埋率更高的納米粒子。Luo等[14]用玉米醇溶蛋白復(fù)合殼聚糖納米粒子成功地荷載了生育酚，并考察了玉米醇溶蛋白與殼聚糖比例對(duì)生育酚的包埋率和釋放動(dòng)力學(xué)的影響。但少有文章深入探究關(guān)于多糖不同分子量對(duì)蛋白多糖納米粒子的性質(zhì)及負(fù)載機(jī)制的影響。

姜黃素（Curcumin，Cur）主要來源于姜科姜黃屬植物姜黃的根莖，具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗腫瘤等多種功能。然而，Cur是一種脂溶性的色素，其水溶性差，僅為11 ng/mL，大部分進(jìn)入人體后從糞便排出，在血液中濃度低。此外，Cur易受光和熱的影響，在光照條件下易分解為阿魏酸和香草醛，生物利用率低和不穩(wěn)定性限制了它在食品中的應(yīng)用。

因此，本研究以姜黃素為模型營(yíng)養(yǎng)成分，圍繞納米營(yíng)養(yǎng)遞送體系中包封率和負(fù)載量較低、突釋現(xiàn)象顯著的問題，通過反溶劑沉淀法構(gòu)建zein-CS納米粒子?？疾霤S分子量、zein與CS質(zhì)量比對(duì)納米粒子及其負(fù)載Cur性能的影響，表征納米粒子結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和緩釋性能，以期揭示其釋放機(jī)理，為構(gòu)建納米營(yíng)養(yǎng)遞送體系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白（純度98.13%），日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；殼聚糖（相對(duì)分子質(zhì)量為5×104Da與1×105Da），天津索羅門生物技術(shù)有限公司；殼聚糖（相對(duì)分子質(zhì)量為3.4×105Da），浙江金殼藥業(yè)有限公司。

無水乙醇（分析純），天津市津東天正試劑公司；冰乙酸（分析純），天津市津東天正化學(xué)試劑廠；去離子水，天津科技大學(xué)。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平：RS-232，丹納赫傳感工業(yè)控制有限公司；離心機(jī)：TDL-5-A，上海安亭科學(xué)儀器廠；磁力攪拌器：HJ-6A，常州市凱航儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)：FD-1，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；超純水系統(tǒng)：Milli-Q，美國(guó)Millpore公司；納米激光粒度儀：BT-90，丹東市百特儀器有限公司；zeta電位儀：Nano-ZS，英國(guó)Malvem公司；掃描電子顯微鏡：SU1510，日本日立株式會(huì)社；傅里葉紅外光譜：TENSOR 27，布魯克儀器公司。

1.3 zein-CS納米粒子的制備

準(zhǔn)確稱量1.0 g的zein粉末，溶于體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇水溶液，配制濃度為10 mg/mL，用作母液。準(zhǔn)確稱量不同分子量的CS（相對(duì)分子質(zhì)量為5×104、1×105和3.4×105Da，分別命名為L(zhǎng)C、MC、HC）粉末，分散于體積分?jǐn)?shù)為1%醋酸水溶液中，充分溶解，配制成不同濃度CS溶液（0.1～0.5 mg/mL）。在磁力攪拌下，使用5 mL規(guī)格的注射器將1 mL母液，以2滴/s的速度滴加到10 mL上述CS溶液中，使得最終的zein/CS質(zhì)量比分別為2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1。攪拌30 min，形成zein-CS納米粒子。根據(jù)粒子中CS分子量的差異，命名為zein-LC，zein-MC，zein-HC納米粒子。

1.4 負(fù)載Cur的zein-CS納米粒子的制備

首先，將1.0 g zein和0.1 g Cur分別加入到50 mL體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇水溶液中，攪拌至充分溶解。在磁力攪拌下，將Cur的乙醇溶液迅速滴加zein溶液中（保證蛋白最終濃度為10 mg/mL），持續(xù)攪拌1 h，離心（3 000 r/min，10 min）除去不溶性雜質(zhì)，配置成荷載Cur的蛋白母液，為橙黃色溶液，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。使? mL規(guī)格的注射器將1 mL荷載Cur的蛋白母液以2滴/s的速度滴加到10 mL不同濃度CS溶液（0.1～0.5 mg/mL）中，使得最終的zein/CS質(zhì)量比分別為2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1。攪拌30 min，形成zein-CS納米粒子。荷載Cur的zein、zein-LC，zein-MC，zein-HC納米粒子，分別命名為Cur/zein，Cur/zein-LC，Cur/zein-MC，Cur/zein-HC。

1.5 zein-CS納米粒子的表征

1.5.1 粒徑與zeta電位

使用納米激光粒度儀測(cè)定納米粒子的粒徑分布和多分散指數(shù)（Polydispersity Index，PDI）。使用zeta電位儀測(cè)定zeta電位。試驗(yàn)條件為（25±0.1）℃，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值。

1.5.2 包封性能

采用凍干復(fù)溶法[15]對(duì)不同粒子的包封率（Encapsulation Efficiency，EE，%）及負(fù)載量（Loading Capacity，LC，%）進(jìn)行了測(cè)定。包封率表示zein包裹Cur的含量，負(fù)載量以zein計(jì)，表示相同量的zein所包封的Cur的含量。參照Chen等[16]的研究方法，Cur的加入量為1.0%（以zein計(jì)），準(zhǔn)確量取4 mL新制備的納米粒子懸浮液，凍干后復(fù)溶于一定量的純乙醇中，渦旋震蕩1 min，隨后，使用離心機(jī)10 000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，用紫外-可見分光光度計(jì)于428 nm測(cè)定游離Cur的吸光度（），通過姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線公式=0.346 3-0.010 2（2=0.999 8）計(jì)算得出游離的Cur含量，Cur的EE和LC通過以下公式計(jì)算：

式中總為被包埋的Cur總量，mg；游為游離Cur的含量mg；Cur為Cur的總量mg；粒子為粒子中zein的總質(zhì)量mg。

1.5.3 掃描電子顯微鏡

使用掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）進(jìn)行納米粒子形貌觀察。操作方法：將一定量納米粒子懸浮液滴加到1 cm2的小玻璃板上，平鋪在桌子上，自然風(fēng)干后將玻璃板貼到導(dǎo)電膠上，真空噴金處理。處理后的納米粒子于掃描電子顯微鏡上觀察，電壓為15 kV。

1.5.4 傅立葉紅外光譜

取1.0 mg納米粒子凍干粉末與150 mg溴化鉀混合，置于研缽內(nèi)充分研磨，壓片。使用傅里葉變換紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀掃描，得到樣品FTIR圖。檢測(cè)條件：室溫、干燥的環(huán)境。掃描范圍：400～4000 cm-1，分辨率：4 cm-1，累加16次，以空氣為背景，每次掃描前扣除背景。

1.6 zein-CS納米粒子的穩(wěn)定性

1.6.1 pH值對(duì)納米粒子的影響

將新制備的納米粒子和去離子水1∶1等體積混合，混合后，調(diào)節(jié)膠體懸浮液pH值為3.0～7.5，用0.1 mol/L NaOH或者HCl溶液對(duì)混合液pH值進(jìn)行調(diào)整。用BT-90激光粒度儀和zeta電位儀檢測(cè)溶液納米粒子性質(zhì)在不同pH值條件下的變化。

1.6.2 離子強(qiáng)度對(duì)納米粒子的影響

將新制備的納米粒子與不同濃度的NaCl溶液等體積混合，使樣品的氯化鈉最終濃度分別為0、100、200和300 mmol/L，調(diào)節(jié)pH值為7.0。用粒度儀和zeta電位儀檢測(cè)溶液納米粒子性質(zhì)在不同pH值（離子強(qiáng)度）條件下的變化。

1.6.3 納米粒子的長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將制備的納米粒子分散液在25℃環(huán)境中放置60 d。用粒度儀和zeta電位儀檢測(cè)放置前后納米粒子性質(zhì)的變化。

1.7 zein-CS納米粒子的緩釋動(dòng)力學(xué)分析

精確稱取一定量的Cur，用乙醇溶解，用磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS，Phosphate Buffered Saline）定容，得到100g/mL的Cur溶液，系列稀釋成1～10g/mL溶液，以用 PBS 緩沖液做空白對(duì)照，在最大吸收波長(zhǎng)428 nm處，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線=0.1916-0.0251（2=0.998）。

取10 mL新制備的載Cur納米粒子懸浮液，置于截留分子量為3 500 Da的透析袋中，隨后將透析袋浸入200 mL PBS緩沖溶液（pH值 7.4）中。將載有透析袋的錐形瓶放置于37 ℃恒溫水浴搖床中，控制搖床速率為100 r/min。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)，取出3 mL透析袋外的緩沖溶液，同時(shí)添加相同體積的空白緩沖液。

式中為某時(shí)刻緩釋溶液釋放Cur的濃度，mg/mL；為某時(shí)刻下緩釋溶液體積，mL；為其中包含Cur的總質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 zein-CS納米粒子特性分析

采用反溶劑沉淀法制備納米顆粒，zein從乙醇相轉(zhuǎn)移到了水相，環(huán)境極性的改變引發(fā)了zein分子的自組裝，而逐滴加入可以減緩zein液滴之間的聚集而致局部濃度過高的情況，從而可以得到粒徑較小、分布均一的 zein納米粒子。為了優(yōu)化納米粒子的制備條件，本試驗(yàn)考察了CS的種類和zein-CS的質(zhì)量比對(duì)納米粒子粒徑、PDI和zeta電位的影響，如表1所示。

表1 CS分子量、zein與CS質(zhì)量比對(duì)zein-CS納米粒子的影響

注：不同小寫字母表示同一指標(biāo)有顯著差異（<0.05）。

Note: Different lowercase letters indicate significant differences in the same index(<0.05).

平均粒徑是通過對(duì)粒徑分布加權(quán)平均得到的一個(gè)反映膠束平均粒子直徑的參數(shù)。對(duì)于分子量較小的LC來說，當(dāng)zein-LC質(zhì)量比為2∶1時(shí)，所制備的納米粒子的平均粒徑最大，在此條件下，CS濃度較高，能夠完全包裹住蛋白分子并與周圍蛋白分子吸附聚集，導(dǎo)致粒徑有所增加；隨著zein-LC質(zhì)量比的增加，制備zein-LC納米粒子的平均粒徑從139.00減小到92.37 nm，這可能是由于CS量的減少?gòu)亩俚奈皆趜ein內(nèi)核的表面，減少蛋白分子吸附聚集。Liang等[17]的報(bào)道表明靜電相互作用可能會(huì)引起CS與zein之間作用更加緊密而導(dǎo)致粒徑減小。此外，Luo等[18]的報(bào)道表明，由于zein的疏水相互作用，所制備的EGCG-CS/zein 納米顆粒更致密，粒徑減小。而對(duì)于MC、HC來說，隨著zein-CS質(zhì)量比的增加，所制備納米粒子的平均粒徑也呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。但MC和HC所制備的納米粒子，其平均粒徑總體上低于LC所制備的納米粒子。陳世蘭等[19]研究表明，CS分子量對(duì)其分子纏繞能力存在影響，即CS分子量越大，分子之間的纏繞程度越大。Zein-MC粒徑相對(duì)較小可能與MC分子的長(zhǎng)度和纏繞能力有關(guān)，從而與zein分子之間相互結(jié)合更加緊密，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)致密。納米粒子粒徑越小，在水溶液中有更好的分散性，越不易聚集產(chǎn)生沉淀[20]。為了繼續(xù)篩選出性能更好的納米粒子，需通過在后續(xù)試驗(yàn)工作中進(jìn)行驗(yàn)證。

PDI用來表明顆粒粒徑的均一性，PDI的值越小，代表顆粒粒徑的分散程度越小，其均一性越好，在PDI值低于0.060時(shí)，可以認(rèn)為顆粒的粒徑是近似均一的。由表 1可以看出，所有樣品的PDI都在0.036～0.049之間，其互相之間的絕對(duì)值也相差較小，可以初步認(rèn)為以上質(zhì)量比制備出的納米粒子都是比較均一的。

zeta電位可以用來表征納米顆粒的表面電荷，一般認(rèn)為，水相體系中分散體zeta電位大于30 mV或小于-30 mV是比較穩(wěn)定的，即絕對(duì)值越大，顆粒的穩(wěn)定性就越高。zein粒子的zeta電位僅為20.86 mV，穩(wěn)定性較低，這是因?yàn)閦ein在水中不溶解，體系穩(wěn)定性差。在加入CS之后，LC和HC所制備的納米粒子的zeta電位均明顯增加，而MC所制備的納米粒子并沒有明顯增加，大多數(shù)仍保持在20.84～44.98 mV之間，這表明LC和HC所制備的納米粒子更加穩(wěn)定。隨著zein-LC與zein-HC中zein∶CS質(zhì)量比增加，zeta電位均呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，且在zein-LC和zein-HC質(zhì)量比為6∶1時(shí)達(dá)最大值，分別為64.41與62.94 mV。這可能是因?yàn)殡S著zein含量增加，CS含量減少，zein表面暴露電荷逐漸增多，zeta電位隨之增加。但隨著zein濃度逐漸增加，在zein與CS質(zhì)量比為8∶1時(shí)，蛋白濃度過高會(huì)發(fā)生聚集，掩蓋內(nèi)部電荷，電位產(chǎn)生先增加后降低趨勢(shì)[21]。研究表明，zein-CS質(zhì)量比變化，會(huì)引起蛋白質(zhì)和多糖上所攜帶電荷密度的比值改變，進(jìn)一步會(huì)影響到二者之間的相互作用，從而制備出的納米顆粒的粒徑、PDI和zeta電位都會(huì)隨之改變[22]。隨著zein與不同分子量CS質(zhì)量比變化，zeta電位變化趨勢(shì)不同可能是因?yàn)閦ein-CS復(fù)合物是疏松的，不同分子量CS形成的網(wǎng)絡(luò)空隙不同，為了進(jìn)一步篩選出具有高包封率和負(fù)載量的納米粒子，后續(xù)對(duì)載Cur的納米粒子進(jìn)行測(cè)定分析。

2.2 載Cur的納米粒子特性分析

先將zein和Cur分別溶于體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇水溶液，并用磁力攪拌器攪拌均勻，再將二者等體積混合攪拌約2 h，此時(shí)zein和Cur發(fā)生特異性相互作用，Cur進(jìn)入到zein的疏水空隙中[23]，隨著zein的自組裝過程，把Cur包裹在了zein內(nèi)部。然后將zein和Cur的混合液滴加到不同質(zhì)量比的CS醋酸水溶液中，攪拌過程中CS擴(kuò)散到水和乙醇的界面，此時(shí)CS和zein發(fā)生靜電、氫鍵、疏水等相互作用，與Cur、zein形成復(fù)合納米顆粒[15、24]。為了制備出特性更好的載Cur納米粒子，首先對(duì)不同CS分子量、不同質(zhì)量比的載Cur納米粒子的粒徑進(jìn)行測(cè)定，如圖1所示。

從圖1中可以看出，空白組平均粒徑為121 nm且均一性較差。圖1a中，zein與LC質(zhì)量比對(duì)納米粒子的粒徑分布影響較大，zein與LC質(zhì)量比為2∶1的粒子的平均粒徑最大，為131 nm，但均一性差；隨著zein與LC質(zhì)量比增加，載Cur納米粒子的平均粒徑呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，在質(zhì)量比為8∶1時(shí)達(dá)到最小值85.2 nm。圖1b中，zein與MC質(zhì)量比對(duì)納米粒子的粒徑分布影響不大，其平均粒徑分布在70.5～82.2 nm之間。圖1c中，zein與HC質(zhì)量比對(duì)納米粒子的粒徑分布影響較大，且與圖1a有相同的變化趨勢(shì)，即隨著質(zhì)量比增加，載Cur納米粒子的平均粒徑呈現(xiàn)先降低后增加，在質(zhì)量比為8∶1時(shí)達(dá)到最小值65.9 nm，與其他質(zhì)量比例的粒子相比，粒徑最小，均一性也最好。

為了進(jìn)一步篩選出CS分子量、zein與CS質(zhì)量比較優(yōu)的粒子，計(jì)算包封率、負(fù)載量結(jié)果如圖1d、1e所示。以Cur/zein為空白組，空白樣品的包封率為82.5%，由圖可知，隨著Cur/zein-CS質(zhì)量比的增加，Cur/zein-LC、Cur/zein-MC與Cur/zein-HC納米粒子對(duì)Cur的包封率和負(fù)載量總體均呈先增加后降低的趨勢(shì)，包封率、負(fù)載量最大可分別達(dá)到81.92%、8.19%（此時(shí)，zein-LC質(zhì)量比為8∶1）；Cur/zein-MC為80.26%、8.03%（此時(shí)，zein-LC質(zhì)量比為4∶1）；Cur/zein-HC為82.93%、8.29%（此時(shí)，zein-HC質(zhì)量比為8∶1）。比較不同CS分子量、zein-CS質(zhì)量比的粒子包封性能可知，zein與殼聚糖的比例為8∶1時(shí)，負(fù)載量最高為8.29%，對(duì)Cur的包埋效果較佳。因此，選用zein與殼聚糖的比例為8∶1的Cur/zein-HC納米粒子進(jìn)行后續(xù)表征試驗(yàn)。

2.3 Cur/zein-HC納米粒子的表征

2.3.1 SEM分析

由圖2可以看出，zein-HC與Cur/zein-HC納米顆粒均為規(guī)則的球形，且分布較為均勻。Cur的加入并沒有引起粒子形態(tài)上的改變，大多數(shù)顆粒的粒徑范圍為80 nm～100 nm，也存在著少數(shù)粒徑更小的粒子。由于用納米激光粒度儀測(cè)其粒徑時(shí)粒子存在于溶液中，而使用SEM時(shí)，待測(cè)溶液已被自然風(fēng)干，粒子存在于干燥的狀態(tài)下，因此激光粒度儀測(cè)出的粒徑要比SEM稍大。這種現(xiàn)象被稱為粒徑收縮現(xiàn)象，當(dāng)粒子存在于溶液中，表面被一層水化層所覆蓋，在自然干燥的過程中，表面水分揮發(fā)到空氣中，納米粒子會(huì)出現(xiàn)明顯的失水皺縮現(xiàn)象[25-27]。

2.3.2 FTIR分析

如圖3所示，3 423 cm-1處觀察到了zein的特征峰，這是由于羥基伸縮振動(dòng)引起的[28]。在zein中加入HC后，特征峰偏移到3 323 cm-1，這表明zein和HC之間存在著氫鍵相互作用，這一結(jié)果與Sun等[29]的研究結(jié)果一致。向zein中加入Cur后，特征峰偏移3 316 cm-1，說明zein和Cur之間也存在著氫鍵。在1 639 cm-1和1 540 cm-1處觀察到zein的主要特征峰，分別歸屬于酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶[30]。C-O基團(tuán)和C-N基團(tuán)的伸縮運(yùn)動(dòng)主要引起了酰胺Ⅰ帶[31]，N-H基團(tuán)彎曲運(yùn)動(dòng)、C-N基團(tuán)伸縮運(yùn)動(dòng)引起酰胺Ⅱ帶[32]。加入HC后，zein-HC特征峰偏移到1 655 cm-1和1 534 cm-1，這是zein與HC間靜電相互作用導(dǎo)致的，相同的結(jié)果在李春亮等[33]的研究中出現(xiàn)。向zein中加入Cur后，特征峰均為1 655 cm-1和1 515 cm-1。這些結(jié)果表明，納米粒子的形成過程中，zein與HC之間不僅存在氫鍵，還存在靜電相互作用。

2.4 Cur/zein-CS納米粒子的形成推測(cè)

根據(jù)結(jié)構(gòu)表征結(jié)果，繪制了Cur/zein-CS納米粒子生成機(jī)制示意圖。如圖4所示，殼聚糖的添加使玉米醇溶蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，粒徑的大小和載樣量取決于殼聚糖的分子量、玉米醇溶蛋白與殼聚糖之間的質(zhì)量比。首先，姜黃素穿插在玉米醇溶蛋白疏水區(qū)域。其次，殼聚糖通過氫鍵、靜電相互作用圍繞在玉米醇溶蛋白的四周，防止其進(jìn)一步聚集。

2.5 zein-HC納米粒子的穩(wěn)定性分析

圖5為納米遞送粒子在不同pH值和離子強(qiáng)度下的穩(wěn)定性結(jié)果。由圖5a中可以看出，在pH值為3.0～4.0時(shí)，顆粒的粒徑在80～120 nm內(nèi)。zein的等電點(diǎn)約為6.2[34]，HC是一種陽離子多糖，等電點(diǎn)約為8.2。由圖5a中可以看出，在pH值為3.0～6.0時(shí)，zein帶有大量的正電荷使得zeta電位為正值，zein與HC之間存在著靜電互斥的作用。pH值為4.5時(shí)，粒徑為440 nm，此時(shí)溶液較為渾濁，隨著pH值的降低，復(fù)合顆粒zeta電位升高，粒徑減小。pH值為3.0～4.0時(shí)，顆粒的粒徑在80～120 nm內(nèi)，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。當(dāng)pH值大于6.5時(shí)，zein表面攜帶負(fù)電荷，zein與HC之間靜電吸引作用使得納米粒子聚集，復(fù)合顆粒的zeta電位值急劇下降。pH增加至7.5時(shí)，粒子的zeta電位同樣急劇降低，這是由于zein帶有較多的負(fù)電荷，與HC之間的靜電互斥作用使溶液趨于穩(wěn)定，納米粒子最大粒徑為2 229 nm。綜合粒徑與zeta電位的數(shù)值得出，納米粒子在酸性條件下更穩(wěn)定。

由圖5b看出，未添加NaCl時(shí)，顆粒粒徑為94 nm，zeta電位為-55 mV，此時(shí)顆粒粒徑較小，且溶液穩(wěn)定。NaCl濃度為100 mmol/L時(shí)，粒徑為275 nm，zeta電位為-38 mV，此時(shí)溶液出現(xiàn)少量的絮沉，整體較為穩(wěn)定。NaCl濃度上升至300 mmol/L時(shí)，顆粒粒徑增大至309 nm，變化較小，說明此時(shí)zein與HC之間具有較強(qiáng)的靜電相互作用，這種作用能抵抗在一定濃度范圍內(nèi)的NaCl所引起的電荷之間的中和作用。但zeta電位變化較大，為-16 mV，由此看出，隨著NaCl濃度的不斷升高，粒子的穩(wěn)定性逐漸降低。當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)增大至400 mmol/L、500 mmol/L時(shí)，此時(shí)溶液中幾乎全部絮沉，超出儀器測(cè)量范圍，zeta電位數(shù)值也較小，溶液穩(wěn)定性變差。

長(zhǎng)期貯存對(duì)Cur/zein-HC納米顆粒穩(wěn)定性的影響如表 2所示，新制備的粒子的粒徑為80.7 nm，PDI為0.042，常溫下存儲(chǔ)60 d后，所測(cè)粒子粒徑為79.3 nm，PDI為0.025。在60 d常溫存儲(chǔ)的過程中，顆粒粒徑僅降低了1.73%，且粒徑分布更加集中，粒子具有較好的均一性和貯存穩(wěn)定性。從zeta電位數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，新制備的粒子電位為46.2 mV，經(jīng)過60 d的存儲(chǔ)后，zeta電位降低至41.8 mV，zeta電位降低了9.52%，但其絕對(duì)值仍然大于30 mV，說明利用HC與zein之間的相互作用制備出的納米顆粒，可以滿足商業(yè)應(yīng)用對(duì)于粒子穩(wěn)定性的要求。

表2 長(zhǎng)期貯存對(duì)Cur/zein-HC納米顆粒穩(wěn)定性的影響

2.6 Cur/zein-HC納米粒子的緩釋性能分析

不同納米粒子在PBS中的緩釋曲線如圖6所示，純的Cur在PBS緩沖液中形成突釋，2 h后，藥物釋放量高達(dá)到79.65%；15 h后，幾乎達(dá)到完全釋放。而包裹了Cur的納米粒子，2 h后僅有34.27%的釋放量；15 h后，達(dá)到75.32%的釋放。經(jīng)過48 h，有76.90%的Cur從Cur/zein-HC納米粒子釋放出來。從純Cur和Cur/zein-HC納米粒子的結(jié)果對(duì)比可以看出，載姜黃素的納米粒子顯示出了明顯的緩慢釋放特性。這種特性主要由2個(gè)原因引起：第一，Cur和zein之間疏水的相互作用力較強(qiáng)，這種作用在一定程度上可以阻止Cur從粒子內(nèi)部釋放出來，從而延長(zhǎng)了釋放時(shí)間[35]。第二，HC作為穩(wěn)定劑，包被在納米粒子的表面，對(duì)粒子形成了第二層保護(hù)，進(jìn)一步地延緩了Cur的釋放[36]。

3 結(jié) 論

在玉米醇溶蛋白與殼聚糖（相對(duì)分子質(zhì)量為3.4×105Da）質(zhì)量比為8∶1時(shí)，制備的納米粒子粒徑較?。?0.13 nm），其zeta電位為46.18 mV。在此條件下，當(dāng)姜黃素添加量為1.0%時(shí)，其包封率和負(fù)載量分別為82.93%和8.29%。納米粒子呈球形，且分布均勻。靜電相互作用及氫鍵是組裝該納米粒子的作用力。殼聚糖的引入提高了納米粒子的pH值、離子及儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍。與游離的姜黃素相比，營(yíng)養(yǎng)遞送納米粒子呈現(xiàn)明顯的緩釋特性。

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Preparation and properties of zein-chitosan nano-nutrient delivery particles

Li Shuhong1, Zhou Junjun1, Chen Guiyun1, Qin Shaoshuang1, Li Heyu2, Chen Ye1※

(1.,,,300457,;2..,.,300457,)

Low oral bioavailability has posed a great challenge on some active substances such as curcumin (Cur) in functional food. Therefore, it is highly demanding for the high water solubility, chemical stabilities, absorption rate, but low metabolic rate in the active substances for the high-quality development of food industries. Currently, the protein and polysaccharide can be expected to construct nano-nutrient delivery, where the complex particles with the diameter of 100-1 000 nm can be considered as an important way to improve the stability and utilization of food-active substances. Zein can also be used to form nano-size spherical particles, thereby embedding into the active substances during antisolvent precipitation in the polar solvent. However, zein nanoparticle is prone to aggregation and precipitation in the dispersion solution. Alternatively, polysaccharides can serve as stabilizers in the preparation of zein nanoparticles. In this study, chitosan with different molecular weights was complexed with zein to fabricate zein-chitosan nanoparticles, in order to achieve the delayed-release capability by the anti-solvent precipitation. An investigation was also made on the effects of chitosan molecular weight (LC: 5×104Da, MC: 1×105Da, HC: 3.4×105Da), while the mass ratio of zein and chitosan (2:1, 4:1, 6:1, 8:1, 10:1) on the particle distribution, zeta potential, the loading Cur performance of zein-chitosan nanoparticles. SEM and FT-IR were selected to characterize the microstructure, morphology, and phase composition, further to elucidate the formation mechanism of composite nanoparticles. Moreover, the slow-release performance and the stability of Cur-loaded composite nanoparticles were evaluated at different pH, ionic strengths, and storage time. The results showed that the Cur-loaded composite nanoparticles presented the smaller particle size of 80.13 nm with a high zeta potential of 46.18 mV, when the mass ratio of zein to chitosan (HC) was 8:1. The encapsulation rate and the loading capacity were 82.93% and 8.29% under the optimal condition, respectively. SEM observation showed that most nanoparticles were in a regularly spherical shape and even distributed in the dispersion solution. FTIR revealed that hydrogen bonding and electrostatic interaction were the main forces for assembling nanoparticles. The formation mechanism of nanoparticles was that the Cur was scattered in the hydrophobic region of zein, whereas, chitosan surrounded the zein via the hydrogen bond and electrostatic interaction to prevent further aggregation. The chitosan greatly contributed to improving the pH, ion, and storage stability of nanoparticles for the extending application, such as nutrition and drug delivery. Specifically, optimal zeta potentials (46.2 to 41.8 mV) were achieved, as the dispersity index (0.042 to 0.025) decreased significantly during 60 days of storage at room temperature. At the same time, there were no significant changes in the particle size. It indicated that the prepared nanoparticles behaved better homogeneity and storage stability, suitable for the requirements of commercial application in the particles. The release results showed that the Cur-loaded composite nanoparticles presented a low release rate of 34.27% at the first 2 hours, while the release rate increased to 75.32% after 15 hours, and finally, 76.90% of Cur was found to be released after 48 h. Sustained-release properties were found in the Cur-loaded nanoparticles for the phosphate-buffered saline (PBS), compared with the free Cur. Consequently, the prepared zein-chitosan nanoparticles with excellent properties can be expected to serve as broad application prospects for nano-nutrient delivery in functional food and medicine.

nutrition; models; zein; chitosan; nanoparticles; sustained release performance

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2021-04-07

2021-08-14

國(guó)家青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31701526）；天津市自然科學(xué)基金（18JCZDJC98100）

李書紅，博士，副教授，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)遞送體系、面制品加工技術(shù)。Email：lsh@tust.edu.cn

陳野，博士，教授，研究方向?yàn)橹参锏鞍啄蹤C(jī)制、農(nóng)產(chǎn)副產(chǎn)物的高值化利用技術(shù)。Email：chenye@tust.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.16.034

TS201. 4

A

1002-6819(2021)-16-0279-08