口含煙中致病菌雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)法的建立

傅婧 佘娟 董睿

目的：建立口含煙中腸道沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)法。方法：在NCBI中檢索腸道沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌的毒素基因序列，設(shè)計(jì)引物和探針;對(duì)收集到的腸道沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌各10株菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，檢查方法特異性;制作陽(yáng)性質(zhì)粒稀釋梯度，探索方法檢出限;調(diào)取30批次實(shí)際樣品，驗(yàn)證方法實(shí)用性。結(jié)果：建立的雙重?zé)晒釶CR法可準(zhǔn)確檢測(cè)腸道沙門(mén)氏菌sseL基因、金黃色葡萄球菌Coa基因，檢出限低至10 copies/μL;在實(shí)際樣品的方法比對(duì)中與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法結(jié)果相同。結(jié)論：雙重?zé)晒釶CR法可有效縮短口含煙中腸道沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌的檢測(cè)時(shí)間并減少實(shí)驗(yàn)操作，具有一定實(shí)用價(jià)值。

口用型無(wú)煙氣煙草制品通俗稱(chēng)為口含煙，主要分類(lèi)有膠基煙、袋裝口含煙、含化煙等，在歐美國(guó)家占有一定市場(chǎng)份額，近年來(lái)在我國(guó)的市場(chǎng)占有率也快速增長(zhǎng)。在產(chǎn)品分類(lèi)上，口含煙屬于食品，安全指標(biāo)包括感官、物理、化學(xué)、微生物等多項(xiàng)檢測(cè)。其中，微生物指標(biāo)包括菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌、致病菌檢測(cè)。

Sa. enterica、St. aureus的基因檢測(cè)研究較為深入，通常選擇16S rRNA序列或毒素基因作為靶標(biāo)。16S rRNA是目前最常用的細(xì)菌系統(tǒng)分類(lèi)分子鐘，但一些報(bào)道稱(chēng)在致病菌檢測(cè)上存在一定誤檢率;另一方面，隨著對(duì)致病菌毒性機(jī)理的深入研究，已有若干毒素基因可供篩選檢測(cè)，特異性更強(qiáng)。本研究設(shè)計(jì)了毒素基因的引物和探針，在收集到的Sa. enterica、St. aureus菌株上進(jìn)行驗(yàn)證，從而建立口含煙中Sa. enterica、St. aureus雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)法。

1 材料

1.1 菌種來(lái)源：從ATCC、CMCC、CTCC等菌種庫(kù)購(gòu)買(mǎi)，從本地醫(yī)院、疾控中心、質(zhì)檢院等單位獲贈(zèng)各10株腸道沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌。

1.2 標(biāo)靶基因：檢索NCBI的Genbank后獲得腸道沙門(mén)氏菌sseL（Salmonella secreted factor L）基因和金黃色葡萄球菌Coa（Staphylocoagulase）基因序列50條以上，首先用Lasergene v11.2.1中的MegAlign軟件比對(duì)出保守序列，使用Oligo v7.60設(shè)計(jì)引物和探針，再用NCBI的Primer-Blast驗(yàn)算篩選，最后進(jìn)行實(shí)踐驗(yàn)證。

2方法

2.1 DNA提取：所有Sa. enterica菌株用BPW培養(yǎng)基、St. aureus菌株用7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基在36 °C增菌18 h，取100 μL用QIAamp DNA Mini Kit提取DNA作為驗(yàn)證材料。

2.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：特選Sa. enterica菌株CMCC（B）50071、St. aureus菌株ATCC6538的DNA提取液，用表1所述引物擴(kuò)增目的基因，切膠回收后接入pMV-20T載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E. coli細(xì)胞JM109，提取質(zhì)粒并稀釋至106 copies/μL，最后再將2種質(zhì)粒稀釋混制成105 copies/μL的陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)液，再用超純水按10倍逐級(jí)稀釋?zhuān)纬?05、104、103、102、10 copies/μL濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.3 陰性及空白對(duì)照組：陰性對(duì)照組包括志賀氏菌（CICC21535）、溶血性鏈球菌（CICC10373）、副溶血性弧菌（CICC21617）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（CICC21633）、大腸桿菌O157

3 結(jié)果

3.1 驗(yàn)證結(jié)果

陰性對(duì)照組（NC）和空白對(duì)照（BC）無(wú)FAM、VIC熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，Ct值 ≥ 40.0。用于驗(yàn)證的10株Sa. enterica菌株在FAM/sseL、10株St. aureus菌株在VIC/Coa熒光信號(hào)上均有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且15.0 ≤ Ct值 ≤ 35.0。此外，所用的St. aureus基因組與Sa. enterica基因組也互為陰性對(duì)照，分別在FAM、VIC信號(hào)上無(wú)熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，Ct值 ≥ 40.0。

S. e.：10株Sa. enterica菌株熒光曲線(xiàn)，S. a.：10株St. aureus菌株熒光曲線(xiàn)，NC：5株陰性對(duì)照株曲線(xiàn)，BC：空白對(duì)照超純水曲線(xiàn)。

3.2 定量檢測(cè)

FAM/sseL、VIC/Coa標(biāo)準(zhǔn)梯度的熒光信號(hào)均有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，F(xiàn)AM/sseL標(biāo)曲Slope -3.46、R2> 0.99，VIC/Coa標(biāo)曲Slope -3.57、R2> 0.99。30批次實(shí)際樣品中，1批次含化煙檢出Sa. enterica、1批次口含煙檢出St. aureus。用設(shè)備自有的熒光PCR儀軟件計(jì)算出樣品中sseL和Coa拷貝數(shù)分別為27.46copies/μL、3.24×102 copies/μL。上述30批次樣品使用GB 4789.4-2016、GB 4789.10-2016進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，同批次檢出Sa. enterica陽(yáng)性、St. aureus陽(yáng)性，其余為陰性，與定量檢測(cè)的定性結(jié)果一致。

4 討論

經(jīng)上述驗(yàn)證，本文設(shè)計(jì)的引物和探針組對(duì)本研究收集的小樣本菌株以及實(shí)際樣品的Sa. enterica、St. aureus能夠有效檢出，檢出限≥10 copies/μL，與文獻(xiàn)報(bào)道的處于同一量級(jí)[]。相比傳統(tǒng)方法的反復(fù)增菌篩選過(guò)程，PCR技術(shù)具有快速簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)更具有原位定量的特性，能夠還原解析樣品自身狀態(tài)。

在定量限方面，可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10 copies/μL濃度的Ct值已接近35，較為合適。原因?yàn)樵趯?shí)際檢測(cè)中，為兼顧準(zhǔn)確與效率，一般將反應(yīng)循環(huán)數(shù)設(shè)為40;因此，若陽(yáng)性結(jié)果Ct值太接近循環(huán)數(shù)，不便于確定檢測(cè)結(jié)果。

在致病菌檢測(cè)領(lǐng)域，分子生物學(xué)方法較為適合。致病菌rRNA檢測(cè)方向上一般以16S rRNA為對(duì)象，但隨著基因測(cè)序的快速積累，23S、ITS也在分型鑒定中啟到重要作用。毒素基因方向上，常見(jiàn)致病菌如Sa. enterica、St. aureus及各血清型的毒性機(jī)理研究已頗為深入，多種相關(guān)基因已用于PCR類(lèi)檢測(cè)，前景較好。

口含煙作為即食食品，除了致病菌檢測(cè)，常規(guī)微生物檢測(cè)是更重要的安全指標(biāo)。但由于分子生物學(xué)檢測(cè)的指向性較強(qiáng)，對(duì)于菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌等廣譜檢驗(yàn)反而較難適用。例如對(duì)于菌落總數(shù)、霉菌、酵母等指標(biāo)，rRNA類(lèi)操縱子在不同菌種間數(shù)量差異較大，難于定量;對(duì)于大腸菌群、耐熱大腸菌群等指標(biāo)，衛(wèi)生學(xué)范圍與遺傳學(xué)范圍無(wú)法完全重合。

參考文獻(xiàn)

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作者簡(jiǎn)介：傅婧，1988年5月，女，漢，籍貫：貴州省貴陽(yáng)市，學(xué)歷：碩士研究生，職稱(chēng)：助理工程師（初級(jí)），研究方向：煙草行業(yè)信息化建設(shè)

基金項(xiàng)目：貴州省科學(xué)技術(shù)基金（編號(hào)：黔科合字[2013]2059號(hào)）;貴州省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科研項(xiàng)目（編號(hào)：2017kj004號(hào)）。