60Co-γ射線輻照對蛹蟲草子實(shí)體生物活性成分的影響

王平 劉桂君 周思靜 喬宇琛 楊素玲

摘要 為研究60Co-γ射線輻照對蛹蟲草中4種生物活性成分的影響，采用劑量分別為5.0、10.0、15.0、20.0 kGy的60Co-γ射線輻照蛹蟲草子實(shí)體干品，采用比色法測定多糖和蟲草酸含量，最后采用高效液相色譜法測定蟲草素及腺苷的含量。結(jié)果表明，0～20 kGy劑量的60Co-γ射線輻照對蛹蟲草子實(shí)體干品中多糖、蟲草酸、蟲草素及腺苷含量的影響不顯著。因此，可采用輻照的方法對蛹蟲草子實(shí)體干品進(jìn)行滅菌。

關(guān)鍵詞 子實(shí)體;多糖;蟲草酸;蟲草素;腺苷

中圖分類號 S 567.3+5? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）20-0202-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.054

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Effects of 60Co-γ Ray Irradiation on the Active Components in the Fruiting Body of Cordyceps militaris

WANG Ping， LIU Gui-jun， ZHOU Si-jing et al? （Beijing Radiation Center， Beijing 100015）

Abstract In order to study the effects of 60Co-γ ray irradiation on four kinds of bioactive components in the fruiting body of Cordyceps militaris， the dried fruiting bodies of C. militarisies were irradiated with 60Co-γ? ray at the doses of 5.0， 10.0， 15.0， 20.0 kGy. The contents of polysaccharide and cordycepic acid were determined by colorimetric method， and the contents of cordycepin and adenosine were determined by high performance liquid chromatography method. The result showed that 60Co-γ ray irradiation at the irradiation dose of 0-20.0 kGy had no significant effect on the content of polysaccharide， cordycepic acid， cordycepin and adenosine in the fruiting bodies of C. militarisies. Therefore， irradiation sterilization method could be used to treat the dried fruiting bodies of C. militaris.

Key words Fruiting bodies;Polysaccharide;Cordycepic acid;Cordycepin;Adenosine

作者簡介 王平（1991—），女，北京人，工程師，從事食藥用資源的開發(fā)與利用研究。*通信作者，高級工程師，博士，從事食藥用資源的開發(fā)與利用研究。

收稿日期 2021-01-21

蛹蟲草（Cordyceps militaris）是我國傳統(tǒng)的食藥用菌，也是獲得國家衛(wèi)生健康委員會批準(zhǔn)的新食品原料，含有蟲草酸、蟲草素、腺苷、多糖等重要的生物活性成分[1]，具有抗腫瘤、提高免疫力、治療白血病、抗炎等多種活性作用[2-5]，具有很高的食用價(jià)值。目前市場上銷售的蛹蟲草主要是人工栽培的蛹蟲草子實(shí)體，由于在栽培及烘干等過程中的處理不當(dāng)，會導(dǎo)致子實(shí)體干品受到污染，在儲存及運(yùn)輸過程中發(fā)霉、變質(zhì)，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量。采用輻照的方式對蛹蟲草子實(shí)體進(jìn)行滅菌處理，能夠減少霉變的發(fā)生，延長子實(shí)體干品的保質(zhì)期，提高產(chǎn)品安全性。

輻照滅菌作為一種常用的滅菌方式，在中藥材滅菌中應(yīng)用較多。因此，研究輻照劑量對生物活性成分含量的影響具有重要意義，可為輻照滅菌劑量的選擇提供重要的參考依據(jù)。秦艽花中龍膽苦苷含量隨著60Co-γ射線輻照劑量的增大而明顯降低，因此秦艽花不適宜用該方法滅菌[6];李躍輝等[7]研究流通蒸汽滅菌法、微波滅菌法及60Co-γ射線輻照滅菌法對牡丹皮中活性成分丹皮酚含量的影響，結(jié)果表明60Co-γ射線輻照滅菌前后牡丹皮中丹皮酚含量基本無變化，可見60Co-γ射線輻照是牡丹皮的最佳滅菌方法;段寶忠等[8]研究不同輻照劑量對川貝母總生物堿及水溶性核苷類成分含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用6、8、10 kGy劑量輻照川貝母后，其總生物堿和水溶性核苷類成分的含量無顯著變化，適宜用輻照滅菌方法。肖滿等[9]研究60Co-γ射線輻照對三七藥材皂苷含量的影響，采用4、6、8 kGy劑量對三七進(jìn)行輻照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未輻照的三七相比，經(jīng)60Co-γ射線輻照后的三七藥材中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1含量變化不顯著，說明三七可以采用輻照的方法滅菌。王春雷等[10]研究60Co-γ射線輻照對白術(shù)有效成分含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)輻照劑量不超過5 kGy 時(shí)各成分含量變化不顯著;當(dāng)輻照劑量為8和10 kGy時(shí)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及蒼術(shù)酮含量均有變化，且蒼術(shù)酮輻照前后含量變化顯著。鄧超[11]研究60Co-γ射線輻照對龍膽和秦艽有效成分的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過輻照后龍膽和秦艽中有效成分含量大多均有不同程度降低，其中龍膽苦苷含量的降低最明顯，說明輻照對龍膽和秦艽有效成分含量有影響，需要根據(jù)情況選擇輻照劑量。

上述文獻(xiàn)報(bào)道表明，不同的中藥材中不同種類的生物活性物質(zhì)對60Co-γ射線輻照劑量的耐受力各不相同，敏感成分會因輻照而改變其分子結(jié)構(gòu)或者降解，因而不適宜采用輻照滅菌的方法，而有些中藥材的生物活性成分則對60Co-γ射線輻照不敏感，成分含量沒有顯著變化，可采用輻照滅菌的方法，因此不同的中藥材需要進(jìn)行研究才能確定是否適宜用輻照滅菌方法。

在蟲草輻照滅菌研究方面，趙小俊等[12]采用8～9 kGy輻照劑量處理蟲草頭孢菌粉，其主要功能成分（腺苷、甘露醇、氮含量）及其他成分（脂肪酸、蛋白質(zhì)、總糖、游離總氨基酸）含量均無顯著變化，維生素C、E的含量下降;黃志勇等[13]研究60Co-γ射線輻照對蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵菌粉的影響，結(jié)果表明8 kGy劑量輻照對發(fā)酵菌粉的感官質(zhì)量及主要成分含量沒有影響。目前尚未見到對蛹蟲草子實(shí)體干品輻照滅菌的相關(guān)報(bào)道。筆者研究了輻照劑量對蛹蟲草子實(shí)體干品中多糖、蟲草酸（即甘露醇）、蟲草素、腺苷等重要活性成分含量的影響，旨在為蛹蟲草60Co-γ射線輻照滅菌的劑量選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料。蛹蟲草子實(shí)體，由北京市輻射中心微生物實(shí)驗(yàn)室固體栽培，收集子實(shí)體后60 ℃烘干。

1.1.2 試劑。蟲草素（cordycepin）、腺苷（adenosine）為HPLC級;甘露醇（mannitol）、葡萄糖（glucose）為分析純，均購自Sigma試劑公司;甲醇為HPLC級，購自上海安譜公司。

1.2 儀器與設(shè)備 主要試驗(yàn)儀器有1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）、M3型多功能酶標(biāo)儀（美國MD公司）、3-18k型冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛹蟲草60Co-γ射線輻照方法。為了保證輻照試驗(yàn)樣品的一致性，將烘干后的蛹蟲草子實(shí)體粉碎成粉末，并混合均勻。將蛹蟲草子實(shí)體粉末分裝在相同大小的離心管中，采用北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院提供的鈷源進(jìn)行輻照，劑量率為50 Gy/min，輻照劑量分別為5、10、15和20 kGy，輻照時(shí)間分別為100、200、300和400 min，輻照結(jié)束后將樣品取出備用。

1.3.2 蛹蟲草子實(shí)體活性成分的提取。

取蛹蟲草子實(shí)體粉末1.0 g，加入50 mL超純水，連接冷凝回流裝置，沸水浴回流提取1 h，使用冷凍離心機(jī)8 000 r/min，離心5 min，棄沉渣，將提取液用超純水補(bǔ)至50 mL定容，然后用0.22 μm無菌濾膜過濾，備測。

1.3.3 多糖含量的測定。

采用苯酚-硫酸法測定葡萄糖含量，用超純水配制濃度100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)稀釋得到濃度分別為10、20、40、80、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，加入6%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，靜止10 min，搖勻，室溫放置20 min。以加入超純水的樣品為空白對照，于波長490 nm處測定光密度值[14]。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取樣品提取液2 mL，分置不同試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，依次加入各試劑，測定波長490 nm處的吸光度值，每個樣品測定3個平行，根據(jù)稀釋度計(jì)算樣品中多糖的含量。

1.3.4 蟲草酸含量的測定。配制甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液1 000 μg/mL，然后用超純水分別稀釋成所需濃度。取濃度分別為50、100、200、400、500 μg/mL的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，分置不同試管中，加入1 mL 15 mmol/L高碘酸鈉溶液混勻，室溫放置10 min后再加入2 mL 0.1% L-鼠李糖溶液，以除去過多的高碘酸鹽，混合后加入4 mL新配制的Nash試劑（150 g醋酸銨+2 mL冰醋酸+2 mL乙酰丙酮，用蒸餾水稀釋定容至1 000 mL），53 ℃下水浴加熱15 min使其呈色，冷卻，在波長412 nm處測定吸光度（OD值），根據(jù)樣品濃度與OD值的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

取樣品提取液1 mL，分置不同試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法，依次加入試劑，水浴加熱，測定波長412 nm處的吸光度值，每個樣品測定3個平行，根據(jù)稀釋度計(jì)算樣品中蟲草酸的含量。

1.3.5 蟲草素及腺苷含量的測定。配制蟲草素及腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后梯度稀釋，蟲草素和腺苷濃度分別為10、20、40、80、100 μg/mL。采用高效液相色譜法（HPLC）測定蟲草素及核苷類物質(zhì)的含量，測定方法如下：DAD檢測器，檢測波長為260 nm，色譜柱為XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，流動相為甲醇∶純水（V/V）15∶85，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫箱溫度為25 ℃。根據(jù)標(biāo)樣濃度與峰面積的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

按照“1.3.2”方法提取的樣品，同樣按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法來測定，再將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣品提取溶液濃度，最后根據(jù)稀釋度計(jì)算樣品中蟲草素及腺苷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖、蟲草酸、蟲草素和腺苷含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

根據(jù)葡萄糖濃度與OD值的關(guān)系，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.007 0x-0.019 9（R2=0.999 1），表明葡萄糖濃度在0～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可見該方法適宜測定葡萄糖濃度在該區(qū)間范圍內(nèi)的樣品。根據(jù)蟲草酸濃度與OD值的關(guān)系，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y = 0.005 7x+0.007 2（R2=0.999 8），表明甘露醇濃度在0～500 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，可見該方法適宜測定甘露醇濃度在該區(qū)間范圍內(nèi)的樣品。根據(jù)蟲草素、腺苷的濃度與峰面積的關(guān)系，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=40.774x+138.870（R2=0.999 1）和y=25.313x-35.662（R2=0.999 7）。這表明蟲草素、腺苷在檢測濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，該方法適合測定該試驗(yàn)中樣品含量。

2.2 HPLC測定蛹蟲草子座色譜圖

將蟲草素與腺苷標(biāo)樣等體積混合，采用高效液相色譜法測定。樣品經(jīng)過色譜柱分離后腺苷、蟲草素的保留時(shí)間分別為8.578和11.125 min，色譜圖如圖1所示，腺苷與蟲草素2個色譜峰分離較好，對于測定其含量無影響。蛹蟲草子實(shí)體回流提取后的樣品溶液采用高效液相色譜法測定，其中未經(jīng)輻照的蛹蟲草子實(shí)體提取液經(jīng)過色譜柱分離后如圖2所示，腺苷、蟲草素的保留時(shí)間分別為8.338和10.975 min。

2.3 蛹蟲草子實(shí)體中多糖、蟲草酸、蟲草素及腺苷的含量測定

根據(jù)比色法測定得到的蛹蟲草子實(shí)體提取液中多糖和蟲草酸含量，采用高效液相色譜法測定蟲草素及腺苷的含量，然后根據(jù)溶液的稀釋倍數(shù)計(jì)算出其在樣品中的含量，得到各個樣品中多糖、蟲草酸、蟲草素、腺苷的含量;最后，使用DPS 18.10統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，測定結(jié)果如表1所示。

由表1可知，蛹蟲草子實(shí)體多糖的平均含量為82.23～82.66 mg/g，經(jīng)過不同劑量輻照后各樣品多糖含量差異不顯

著，說明0～20 kGy對蛹蟲草子實(shí)體中多糖含量的影響不大，此劑量范圍的輻照不會使多糖含量明顯降低;蛹蟲草子實(shí)體中蟲草酸的平均含量為7 272.50～7 284.10 μg/g，經(jīng)過0～20 kGy 劑量的輻照后各樣品蟲草酸的含量差異不顯著，說明輻照沒有引起蟲草酸的變化，從而導(dǎo)致其含量升高或降低;蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素的平均含量為4 410.90～4 420.30 μg/g，腺苷的平均含量為1 420.80～1 426.60 μg/g，經(jīng)過0～20 kGy劑量的輻照各樣品蟲草素及腺苷含量差異不顯著，說明此范圍的輻照劑量對蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素及腺苷含量的影響很小。通過對蛹蟲草子實(shí)體的活性成分含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)輻照與經(jīng)過不同劑量輻照的蛹蟲草子實(shí)體多糖、蟲草酸、蟲草素、腺苷的含量無顯著差異（P>0.05），說明0～20 kGy劑量的輻照不會影響蛹蟲草子實(shí)體的品質(zhì)。

3 結(jié)論

蛹蟲草子實(shí)體經(jīng)過0、5、10、15、20 kGy輻照后，其多糖、蟲草酸、蟲草素、腺苷含量變化不顯著，說明0～20 kGy劑量的輻照對蛹蟲草子實(shí)體中這4種成分含量的影響較小，且這4種生物活性成分是蛹蟲草的主要成分，可見輻照滅菌對蛹蟲草子實(shí)體干品中多糖、蟲草酸、蟲草素、腺苷4種主要生物活性成分的影響小，因此該方法是一種適合于蛹蟲草子實(shí)體干品的滅菌方法。

參考文獻(xiàn)

[1]

梁宗琦.中國真菌志：第32卷 蟲草屬[M].北京：科學(xué)出版社，2007：10-47.

[2] FAN B Y，ZHU H B.Cordycepin：Pharmacological properties and their relevant mechanisms [J].TANG， 201? 2（2）：14.1-14.7.

[3] 康冀川，康超，文庭池，等.蟲草菌素藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].菌物學(xué)報(bào)，201 30（2）：191-197.

[4] REN Z H，CUI J H，HUO Z R，et al. Cordycepin suppresses TNF-α-induced NF-κB activation by reducing p65 transcriptional activity， inhibiting IκBα phosphorylation， and blocking IKKγ ubiquitination[J].International immunopharmacology， 201? 14（4）：698-703.

[5] 吳勇，陳衛(wèi)東.蛹蟲草藥理作用研究概述[J].中國藥師，201 14（5）：732-734.

[6] 崔文婷，譚睿，羅琴，等.60Co-γ輻照滅菌對秦艽花中龍膽苦苷含量的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，201 40（22）：11227-11228，11282.

[7] 李躍輝，王銀，張水寒，等.滅菌方法對牡丹皮粉體主要成分含量的影響[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，201 2（13）：41-4 72.

[8] 段寶忠，黃林芳.60Co-γ射線輻照貯藏對川貝母質(zhì)量的影響[J].中國藥房，201 23（15）：1391-1392.

[9] 肖滿，吳艷，馬江南，等.60Co-γ輻照滅菌對三七藥材質(zhì)量的影響[J].湖南中醫(yī)雜志，2020，36（3）：150-15 175.

[10] 王春雷，姜建偉，侯桂蘭. 鈷-60 射線輻照對白術(shù)藥材中4 種有效成分的影響研究[J].中國藥師，2018，21（8）：1358-1362.

[11] 鄧超. 高效液相色譜指紋圖譜分析鈷60輻照前后龍膽和秦艽成分變化[J].生物化工，2020，6（2）：56-59.

[12] 趙小俊，史建君，孫志明，等.蟲草頭孢菌粉輻照滅菌及對其主要成分的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，200 36（9）：1081-1085.

[13]? 黃志勇，陳慶隆，曹豐生，等.發(fā)酵蟲草菌粉輻照滅菌研究[J].江西農(nóng)業(yè)科技，2002（6）：17-18.

[14]? 張惟杰.糖復(fù)合物生化技術(shù)研究[M].杭州：浙江大學(xué)出版社，1994：16.

[15] ?劉桂君，周思靜，林金星.培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草中蟲草酸及核苷類物質(zhì)的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41（5）：94-98.