黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌抑制效果研究

賈正燕 王昌梅 張嘯 趙興玲 吳凱 尹芳 楊斌 梁承月 張無敵

摘要 [目的]探究黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）的抑菌效果，為深入研究中藥對(duì)植物根腐病防治提供科學(xué)參考。[方法]將黃連剪成0.5 cm左右的小段，稱取10 g黃連，加入150? mL無菌水煮沸，小火熬30 min，提取其有效成分，得黃連水提液。采用二倍稀釋法和菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌的最小抑菌濃度及最適抑菌量。[結(jié)果]1? g/mL黃連水提液稀釋后對(duì)腐皮鐮孢菌的抑菌效果較差，4 d平均抑菌率不到20%，最小抑菌濃度為16 mg/mL;1? g/mL的黃連水提液增加用量后對(duì)腐皮鐮孢菌的抑制效果明顯增加，最適用量為0.3? mL，此時(shí)最大抑菌率可達(dá)76.56%，最大平均抑菌率達(dá)57%。[結(jié)論]不同濃度及不同用量黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌的菌絲生長(zhǎng)具有顯著影響，最小抑菌濃度為16 mg/mL，最適抑菌量為0.3? mL。

關(guān)鍵詞 根腐病;腐皮鐮孢菌;黃連水提液;最小抑菌濃度;最適抑菌量

中圖分類號(hào) R 285? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）20-0195-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.051

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Inhibitory Effect of the Water Extract of Coptis chinensis on Fusarium solani

JIA Zheng-yan WANG Chang-mei? ZHANG Xiao3 et al （1.Yunnan Normal University，Kunming，Yunnan 650500;2.Jilin Dongsheng Biomass Energy Engineering Research Institute，Tonghua，Jilin 134118;3.Yunnan Kangyi Sanqi Planting Co.，Ltd.，Kunming，Yunnan 650032）

Abstract [Objective]To investigate the antibacterial effect of water extract of C.chinensis on F.solani，and to provide scientific reference for further research on the prevention and treatment of plant root rot.[Method]C.chinensis was cut into small pieces about 0.5 cm，weighed 10 g of C.chinensis，added 150? mL sterile water to boil for 30 min at low fire，and the effective components were extracted to obtain water extract of C.chinensis.The minimum inhibitory concentration and the optimal inhibitory amount of water extract of C.chinensis against F.solani were determined by double dilution method and mycelial growth rate method.[Result]The antibacterial effect of 1? g/mL water extract of C.chinensis on F.solani was poor.The average antibacterial rate of 4 d was less than 20%，and the MIC value was 16 mg/mL.When the dosage of water extract of 1? g/mL of C.chinensis was increased，the inhibition effect on F.solani was significantly increased.The most suitable dosage was 0.3? mL，and the maximum and average inhibition rate reached 76.56% and 57% at this time.[Conclusion]The different concentrations and dosages of water extract of C.chinensis have significant effects on the mycelial growth of F.solani.The MIC is 16 mg/mL，and the optimal bacteriostatic amount is 0.3? mL.

Key words Root rot;F.solani;Water extract of C.chinensis;Minimum inhibitory concentration;Optimum inhibitory amount

基金項(xiàng)目 云南省萬人計(jì)劃產(chǎn)業(yè)技術(shù)領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（20191096）;吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20200402099NC，20200403010SF）;云南省國(guó)際科技合作專項(xiàng)（202003AF140001）;昆明市國(guó)際科技合作基地、云南省農(nóng)村能源工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金聯(lián)合項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介 賈正燕（1997—），女，云南永善人，碩士研究生，研究方向：生物質(zhì)能。*通信作者，研究員，博士生導(dǎo)師，從事生物質(zhì)能與環(huán)境工程教學(xué)科研工作。

收稿日期 2021-03-16

三七（Panax notoginseng（BurK.）F.H.Chen，P.notoginseng），又名田七、人參三七、田三七、山漆、三七參等，以其根部入藥，其性溫，味辛，具有顯著的活血化瘀、消腫定痛功效，有“金不換”“南國(guó)神草”之美譽(yù)[1]。三七在云南省文山市已有400多年的種植歷史，其種植面積和單產(chǎn)已達(dá)到我國(guó)的90%以上[2]，然而，在種植過程中會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的連作障礙問題，導(dǎo)致三七的產(chǎn)量下降和質(zhì)量下降[3]。據(jù)報(bào)道，連作障礙的主要原因?yàn)楦?，引起根腐病的病原體包括圓柱狀腐霉、尖孢鐮刀菌、鏈霉菌、腐皮鐮孢菌等[4]。

黃連為毛茛科黃連屬植物黃連（Coptis chinensis Franc）的干燥根莖[5]。目前，已從黃連中分離并鑒定出128種化學(xué)成分。從黃連中分離的提取物/化合物涵蓋了廣泛的藥理學(xué)范圍，包括抗菌、抗病毒、抗真菌、抗糖尿病、抗癌和心臟保護(hù)作用[6]。該研究選用黃連為原料，通過水煎提取黃連中的有效成分，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)試了黃連水提液對(duì)三七根腐病原菌中腐皮鐮孢菌的抑制活性，探討黃連水提液對(duì)農(nóng)業(yè)病原菌的抑制作用，為基于天然產(chǎn)物的植物源抑菌劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材。馬鈴薯，市售;瓊脂條，購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖，購于天津市大茂化學(xué)試劑廠;95% 乙醇。PDA培養(yǎng)基：取240 g馬鈴薯（去皮，切為1.0 cm左右的正方形小塊）加入1 200 mL水煮30 min過濾，濾液中加入29 g葡萄糖混合均勻，定容，分裝入6個(gè)500 mL錐形瓶中，分別加入2 g瓊脂條，121 ℃高溫滅菌20 min。腐皮鐮孢菌（Fusarium solani），由云南省農(nóng)村能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離提供，分離自文山三七根腐病病樣。黃連（市售），烘干，剪成0.5 cm左右的小段。

1.1.2 儀器。SQ810C型高壓蒸汽滅菌鍋、RE-5298A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、AIRTECH型超凈工作臺(tái)、101型鼓風(fēng)干燥箱、GH-400BC隔水式恒溫培養(yǎng)箱、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵、燒杯、無菌打孔器、玻璃棒、紗布、培養(yǎng)皿、鑷子、電磁爐、接種環(huán)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng)。

將腐皮鐮孢菌接種至提前備好的PDA培養(yǎng)基上，在恒溫隔水式培養(yǎng)箱中恒溫（T=30 ℃）培養(yǎng)，直至菌株長(zhǎng)滿整個(gè)平板。

1.2.2 黃連水提液的制備。

黃連剪成0.5 cm左右的小段，稱取10 g黃連，加入150 mL無菌水煮沸，小火熬30 min，待冷卻后抽濾。將所得濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在65 ℃下減壓濃縮，制成浸膏，無菌蒸餾水定容至10 mL，制成1 g/mL的黃連水提液，放4 ℃冰箱備用。

1.2.3 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定。

MIC定義為在可見的情況下會(huì)明顯抑制生物體生長(zhǎng)的抗菌物質(zhì)的最低濃度[7]。即取1 g/mL的黃連水提液，用無菌蒸餾水倍比稀釋成500、250、125、63、31、16、8、4、2和1 mg/mL共10個(gè)濃度梯度。用移液器分別吸取0.1 mL稀釋好的黃連水提液于提前備好的PDA培養(yǎng)基表面涂布均勻，與腐皮鐮孢菌共同培養(yǎng)4 d。各設(shè)3個(gè)平行，對(duì)照用無菌水，空白組直接放菌塊。

1.2.4 最適抑菌量的測(cè)定。

最適抑菌量定義為在可見的情況下繼續(xù)增加用量會(huì)使抑菌效果緩慢增加甚至下降的抗菌物質(zhì)的最低濃度。即取濃度為1 g/mL黃連水提液，增加提取液的用量，梯度為0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 mL，用移液器吸取相應(yīng)水提液于提前備好的PDA培養(yǎng)基表面涂布均勻，與腐皮鐮孢菌共同培養(yǎng)4 d。各設(shè)3個(gè)平行，對(duì)照用無菌水，空白組直接放菌塊。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用生長(zhǎng)速率法計(jì)算抑制菌絲生長(zhǎng)率。

抑菌率=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑×100%[8]。

2 結(jié)果與分析

取不同濃度梯度的黃連提取液和不同用量黃連水提液在提前備好的培養(yǎng)皿上涂布均勻，與腐皮鐮孢菌放入30 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)，每24 h記錄1次數(shù)據(jù)。腐皮鐮孢菌培養(yǎng)4 d后的生長(zhǎng)情況（圖1）可以看出，與對(duì)照組相比，黃連水提液濃度為500 mg/mL對(duì)腐皮鐮孢菌抑菌效果較好，濃度為1 mg/mL時(shí)對(duì)腐皮鐮孢菌幾乎無抑菌效果;對(duì)照組和空白組腐皮鐮孢菌生長(zhǎng)情況無明顯差異。黃連水提液增加用量后，0.1 mL抑菌率較差，0.3～1.0 mL抑菌效果非常好。

2.1 黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌最小抑菌率（MIC）的測(cè)定

取稀釋后的黃連水提液在提取備好的培養(yǎng)皿上涂布均勻，與腐皮鐮孢菌放入30 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，每24 h記錄1次數(shù)據(jù)。測(cè)定結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，培養(yǎng)4 d后，黃連水提液濃度為500、250、125、63和31 mg/mL 時(shí)對(duì)腐皮鐮孢菌有一定的抑菌效果，最大抑菌率為26.56%。隨著濃度的降低，抑菌物質(zhì)濃度隨之降低，對(duì)腐皮鐮孢菌基本不表現(xiàn)抑菌作用，導(dǎo)致抑菌效果下降。

不同濃度黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌抑菌率的方差分析如表1所示，顯著性分析如表2所示。由表1可得，不同濃度黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌的抑菌率有顯著影響，說明不同濃度的黃連水提液會(huì)對(duì)腐皮鐮孢菌的抑制產(chǎn)生重要影響。由表2可得，濃度為500、250、125、63和31 mg/mL之間抑菌效果無顯著差異，濃度為16、8、4、2、1 mg/mL和對(duì)照之間抑菌效果無顯著差異，但前者和后者之間存在極顯著差異。前5個(gè)不同濃度梯度的黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌有一定的抑菌效果，從16 mg/mL開始，各濃度黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌基本沒有抑菌效果，MIC為16 mg/mL。

2.2 黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌最適抑菌量的測(cè)定 取濃度為1 g/mL的黃連水提液，增加用量，設(shè)置梯度為0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 mL，觀察提取液對(duì)腐皮鐮孢菌的抑制效果。從圖3可以看出，培養(yǎng)4 d后，隨著用量的增加，黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌的抑菌率在0.3 mL時(shí)達(dá)到76.58%，繼續(xù)增加用量，抑菌率緩慢增加，最大可達(dá)77.69%。當(dāng)水提液用量為1.0 mL 時(shí)，抑菌率反而減小。由此可得最適抑菌量為0.3 mL。與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組對(duì)腐皮鐮孢菌的抑制效果顯著。

不同用量黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌抑菌率的方差分析如表3所示，顯著性分析如表4所示。由表3可得，不同用量黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌的抑菌率有顯著影響，說明不同用量的黃連水提液會(huì)對(duì)腐皮鐮孢菌的抑制產(chǎn)生重要影響。由表4可得，用量為0.3、0.5、0.7、1.0 mL時(shí)抑菌效果無顯著差異，但0.1 mL與0.3、0.5、0.7、1.0 mL間抑菌效果存在極顯著差異，且0.1 mL與對(duì)照組無顯著差異。說明黃連提取液用量為0.3～1.0 mL時(shí)對(duì)腐皮鐮孢菌抑菌效果較明顯，最適抑菌量為0.3 mL。

3 討論與結(jié)論

黃連因其優(yōu)良的藥用特性而聞名。Sharma等[6]研究發(fā)現(xiàn)黃連水提液中的主要活性成分包括小檗堿、麻風(fēng)樹堿和棕櫚堿等生物堿。已有相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)黃連在抗金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌和淋病奈瑟氏菌等革蘭氏陰性菌及抗假絲酵母菌、白色念珠菌等真菌方面有明顯的優(yōu)勢(shì)[9]。

等[10]研究發(fā)現(xiàn)黃連水提液對(duì)葡萄炭疽病菌、葡萄灰霉病菌、西瓜蔓枯病菌、辣椒疫霉病菌和玉米莖基腐病菌5種植物病原真菌均有較好的抑制作用。Ren等[11]研究30種中草藥對(duì)食品中真菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)黃連的水提物有很強(qiáng)的抗菌能力。Su等[12]研究了16種中藥對(duì)嗜水氣單胞菌的體外抗菌作用，結(jié)果表明，不同類型的中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌有不同的抗菌作用;黃連水提物具有較強(qiáng)的抑菌活性，MIC值為15.63 mg/mL;Qu等[13]采用液體稀釋法測(cè)定半夏瀉心湯和7種中藥對(duì)8株耐藥菌株體外抗菌作用，結(jié)果顯示，7種單味中有4種中藥具有抑菌作用，該湯對(duì)8種耐藥菌株具有較強(qiáng)的抑菌作用，黃連提取液MIC為0.16 mg/mL。

該試驗(yàn)通過生長(zhǎng)速率法，利用水煎提取黃連中的活性成分，所得提取液分別對(duì)三七根腐病原菌中腐皮鐮孢菌進(jìn)行抑菌效果研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度梯度和不同用量黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌有不同的抑菌效果，不同濃度黃連水提液對(duì)腐皮鐮孢菌抑菌率均小于30%，最大抑菌率為26.56%;培養(yǎng)4 d所得平均抑菌率均小于20%，當(dāng)水提液濃度小于16 mg/mL時(shí)，幾乎無抑菌效果，MIC為16 mg/mL。濃度為1 g/mL 的黃連水提液增加用量后，當(dāng)用量為0.3 mL時(shí)抑菌率達(dá)到76.58%，繼續(xù)增加用量，抑菌率緩慢增加，最大可達(dá)77.69%;當(dāng)水提液用量為1.0 mL時(shí)，抑菌率反而減小;由此可得，水提液最適抑菌量為0.3 mL。原因可能是提取液用量越多，液體在培養(yǎng)皿表面停留時(shí)間越長(zhǎng)，孢子在表面擴(kuò)散生長(zhǎng)，使得抑菌效果減弱[14]。

黃連的使用具有上千年的歷史，現(xiàn)代研究表明其對(duì)多種微生物的生長(zhǎng)有抗菌作用，但微生物不同，其抗菌成分有差異[9];而且用不同的方法提取黃連有效成分，所得有效成分不同，其抑菌作用也有差異。該試驗(yàn)通過水煎提取黃連中的抑菌活性成分，以抑制三七根腐病原菌腐皮鐮孢菌的生長(zhǎng)，為三七根腐病的防治以及植物性殺菌劑的開發(fā)奠定良好的基礎(chǔ)。

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