水稻苗期高溫RNA-SEQ分析

張偉 張亞龍 臺德衛(wèi) 張效忠 汪婉琳

摘要 利用水稻苗期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析在高溫處理條件下不同時間段基因表達水平變化，篩選出可能參與高溫?zé)岷Φ幕?。LOC_Os04g04970、LOC_Os03g15960和LOC_Os03g51459，其在受到熱處理1 h的表達水平顯著上調(diào)，隨著熱處理的時間延長，其表達水平逐漸降低，可能與熱處理相關(guān)。該研究可為進一步揭示水稻苗期高溫?zé)岷Ψ肿由飳W(xué)研究提供參考。

關(guān)鍵詞 水稻;苗期;高溫脅迫;轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號 S 511? 文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）20-0120-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.030

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

High Temperature RNA-SEQ Analysis of Rice Seedling

ZHANG Wei ZHANG Ya-long TAI De-wei1 et al （1.Rice Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei，Anhui 230031;2.University of Washington，WA，U.S.A 98195）

Abstract This study used rice seedling transcriptome data to analyze the changes in gene expression levels at different time periods under high temperature treatment conditions， and screened out three genes （LOC_Os04g04970， LOC_Os03g15960 and LOC_Os03g51459） with significant changes in expression levels at each time period. Their expression level was significantly up-regulated after 1 hour of heat treatment， and gradually decreased with the extension of heat treatment， which may be related to heat treatment. This study will provide a reference for further revealing the molecular biology of high temperature heat damage in rice seedlings.

Key words Rice;Seeding stage;Heat stress;RNA-seq

基金項目 安徽省科技重大專項（h202003a06020005）;科技部國際合作司常規(guī)性科技援助項目（KY202001010）。

作者簡介 張偉（1985—），男，安徽臨泉人，助理研究員，博士，從事分子生物學(xué)與生物信息學(xué)研究。

收稿日期 2020-12-17;修回日期 2021-01-19

近年來，隨著環(huán)境的變化，高溫天氣頻繁出現(xiàn)，高溫正影響我國長江中下游的水稻生產(chǎn)[1]。當(dāng)日最高溫度高于水稻適宜生長溫度范圍時，會影響水稻的生理生長和生殖生長，造成植物光合作用系統(tǒng)、細胞膜穩(wěn)定性、激素等方面發(fā)生變化，甚至導(dǎo)致植物死亡[2]。高溫通過影響植株生理生長和生殖生長，最終表現(xiàn)為產(chǎn)量下降，品質(zhì)降低[3-4]。

在水稻生殖生長階段和成熟階段遇到高溫時危害較嚴重，水稻在整個生長發(fā)育過程中對高溫敏感的時期首先是抽穗開花期[5-7]，花粉成熟、花藥開裂、花粉在柱頭上發(fā)芽和花粉管伸長等均受到影響，在水稻減數(shù)分裂期如遇35 ℃以上高溫并持續(xù)3 d及以上，會導(dǎo)致水稻花器發(fā)育不全，花藥開裂率下降，花粉發(fā)育不良，花粉育性和活力下降等[8-9]，最終影響結(jié)實率。抽穗至成熟階段高溫會加快灌漿速率，縮短灌漿的持續(xù)期，籽粒光合產(chǎn)物不足，淀粉及其他有機物積累減少，使籽粒的充實度（千粒重）受到影響，米粒堊白增加，透明度變差[10]。高溫不但在孕穗期、開花期、灌漿期等生育時期影響水稻生產(chǎn)，在營養(yǎng)生長時期受到高溫時對植株的生長也產(chǎn)生重要影響，如導(dǎo)致植株生長速度下降，葉色變淡等[11]，尤其是在水稻幼苗時期，受到高溫脅迫時水稻葉片中蛋白種類和含量變化較大，植株高度、干物質(zhì)含量性狀也會發(fā)生變化[12-13]，對水稻植株產(chǎn)生過氧化傷害作用[14]，進而影響水稻植株后期的生長進程。

當(dāng)前很多研究集中于水稻生殖生長階段，對生理生長階段研究較少，水稻苗期是水稻生理生長重要階段之一，而關(guān)于水稻苗期受到高溫處理其基因表達方面的研究較少。隨

著生物信息學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展，為水稻基因組、轉(zhuǎn)錄組、生理生化等方面的研究提供了技術(shù)保障，也為揭示水稻耐高溫研究注入新的動力。該研究利用水稻苗期高溫處理的RNA-seq數(shù)據(jù)，使用Hisat2+Deseq2分析表達水平差異顯著的基因[15-16]，進而預(yù)測和發(fā)掘水稻苗期與高溫處理相關(guān)基因，旨在為水稻高溫相關(guān)基因進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從 The Rice Annotation? Project （RAP）數(shù)據(jù)庫下載 Os-Nipponbare-Reference- IRGSP-1.0 的水稻基因組序列作為參考基因組和基因組注釋文件（http：∥rice.plantbiology.msu.edu/downloads.shtml）。從NCBI（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）利用sratoolkit下載并拆分水稻的 SRA（PRJNA530826）數(shù)據(jù)。

1.2 試驗方法 利用trimmomatic過濾低質(zhì)量的reads和接頭，用fastqc評估數(shù)據(jù)質(zhì)量是否可以用于后續(xù)分析。利用Hisat2將reads比對到基因組，接著利用stringtie將比對上的reads進行轉(zhuǎn)錄組組裝，利用stringtie merge進行合并，合并后對組裝的轉(zhuǎn)錄本進行表達水平的計算。利用prepDE.py將計數(shù)轉(zhuǎn)換為Deseq2輸入文件。利用Deseq2進行基因差異表達分析，篩選條件（閾值）：絕對log2FC> 并且Padj<0.0 用ggplots作圖。每個時段均有差異表達基因，利用Python code將每個時段均差異顯著的基因取出，進行表達量計算分析，用pheatmap繪heatmap圖。

2 結(jié)果與分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載水稻日本晴14 d苗期莖和葉受到熱處理的RNA seq原始數(shù)據(jù)（表1），處理時間分別為1、3、6、12、24、36和48 h，每個時間段3次重復(fù)。去除接頭和低質(zhì)量的reads后獲得高質(zhì)量的reads用于下一步分析。

利用Hisat2軟件建立日本晴基因組索引，利用Hisat2分別將reads比對到基因組上，運行stringtie獲得含有count的gtf文件，利用prepDE.py轉(zhuǎn)換得到的數(shù)據(jù)用于下一步統(tǒng)計分析。

Deseq2分析差異表達基因，得到每個處理時段差異表達的基因，表明當(dāng)受到熱處理時，一系列相關(guān)基因表達水平發(fā)生變化，如圖1所示。進一步分析發(fā)現(xiàn)，有些基因在所有處理時段均上調(diào)或者下調(diào)。利用Python code提取這些基因的counts，用于分析這些基因在受到熱處理時不同時期的表達水平（圖2、3），表明這些基因在受到熱處理后，其表達水平顯著下調(diào)或者上調(diào)。其中，LOC_Os04g04970、LOC_Os03g15960和LOC_Os03g51459 3個基因在受到熱處理1 h的表達水平顯著上調(diào)，隨著熱處理的時間延長，其表達水平逐漸降低，可能與熱處理相關(guān)。LOC_Os03g15960編碼heat shock protein，另外2個功能鮮見報道，仍需要進一步研究。LOC_Os02g35750和LOC_Os03g11910在處理3 h表達水平顯著上調(diào)，隨著處理時間的延長，其表達水平逐漸降低。LOC_Os02g35750可能在葉發(fā)育早期與葉綠體生成有關(guān)[17]，然而，其表達水平受到熱處理影響，是否也參與水稻苗期高溫脅迫途徑仍需進一步研究。LOC_Os03g11910是Hsp70家族成員，在保護植物免受非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用[18]，尚需揭示該基因的生物學(xué)功能。圖3顯示，這些基因經(jīng)過高溫處理后，其表達水平顯著下調(diào)，需要在進一步的生物學(xué)研究過程中揭示它們的生物學(xué)功能。

3 討論

該研究分析表明，在水稻苗期高溫脅迫處理條件下，一些基因在各處理時段均上調(diào)，其中有些基因在處理1 h表達水平顯著上調(diào)，隨著處理時間的推移，其表達水平逐漸降低，它們與已報道的功能基因功能相符，這進一步證明該研究的可靠性。采用取交集的方式，發(fā)掘每個時期均上調(diào)或下調(diào)基因，在方法上具有創(chuàng)新性，同時增加了發(fā)掘基因的可靠性，為苗期耐熱基因功能研究提供有價值的參考。該研究所用材料為日本晴，作為水稻參考材料適用于多方面的研究，然而若選用耐熱的極端材料進行研究，將能更加充分發(fā)掘耐熱關(guān)鍵基因，將繼續(xù)開展這方面的研究。該研究利用多種處理時段的數(shù)據(jù)挖掘水稻苗期耐熱關(guān)鍵基因，為水稻苗期耐熱基因功能與機制分析提供基礎(chǔ)具有實際意義。

4 結(jié)論

該研究分析出3個基因（LOC_Os04g04970、LOC_Os03g15960和LOC_Os03g51459）很可能與水稻苗期受到熱脅迫相關(guān)。

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