玉米象的形態(tài)和分子特征鑒定

鄒茗惠 許薇 薛琪琪 朱志偉 李媛媛 趙金紅

摘要 [目的]通過形態(tài)和分子特征鑒定玉米象。[方法]從采集到的大米樣本中分離出玉米象，分別在高速度數碼顯微系統(tǒng)和掃描電鏡下觀察其外部形態(tài)和細微形態(tài)并進行拍照鑒定。同時提取DNA對cox1和ITS基因進行測序和分析。[結果]玉米象的體軀由頭、胸、腹3部分組成，胸部由3個胸節(jié)組成，有胸足3對，體表散布密集的刻點。明顯的鑒別特征有頭部的額和頰延伸成象鼻狀的喙，觸角呈膝狀彎曲，共見8個小節(jié)，口器位于細長喙的端部，上唇基本退化，代之為口上片，下顎須和下唇須退化而僵直，外咽片消失。雄蟲外生殖器隱藏于腹部，來源于第9腹節(jié)，陽莖背面扁平，有2條平行的縱凹溝，雌蟲Y形骨片尖。經克隆PCR擴增得到cox1、ITS基因片段大小分別為441、1 445 bp，與已報道的玉米象cox1基因同源性分別為99.7%～100%，ITS基因為99.0%～99.3%。[結論]根據高速度數碼顯微系統(tǒng)和電鏡下玉米象的形態(tài)特征，結合cox1和ITS基因序列分析，可為玉米象的鑒定和生物學分類提供依據，也可為防治玉米象對儲糧的危害奠定基礎。

關鍵詞 玉米象;外部形態(tài);分子特征

中圖分類號 S 379.5? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）20-0113-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.029

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Morphology Observation and Molecular Characteristics of the Sitophilus zeamais

ZOU Ming-hui，XU Wei，XUE Qi-qi et al （Department of Medical Parasitology，Wannan Medical College，Wuhu，Anhui 241002）

Abstract [Objective]To identify Sitophilus zeamais according to morphology and molecular characteristics.[Method]Sitophilus zeamais were collected from the rice，then observed under an high speed digital microscope system and scanning electron microscope.PCR and walking sequencing were used to obtain cox1 and ITS sequences of the DNA samples extracted from Sitophilus zeamais.[Result]The body of Sitophilus zeamais was composed of three parts： head，chest and abdomen.The chest was composed of three thoracic ganglia，which had three pairs of feet.The distinguishing features were as follows： the forehead and cheek of the head extend into an elephant nose-like beak，the antennae bend knee-like，a total of 8 sections can be seen，the mouth organ is located at the end of the slender beak，the upper lip was basically degenerated，replaced by the upper lip，the mandibular and lower lip whiskers were degenerated and rigid，and the external pharynx slice disappears.The male genitalia was hidden in the abdomen and originates from the 9th abdominal ganglion.The dorsal surface of the male was flat with two parallel longitudinal grooves.The length of ITS and cox1 from the Sitophilus zeamais were 1 445 bp and 441 bp，respectively.Compared with reported Sitophilus zeamais，the homology of cox1 and ITS gene were 99.7%-100% and 99.0%-99.3%，respectively.[Conclusion]The Sitophilus zeamais was identified according to the morphological characteristics under high speed digital microscope system and scanning electron microscope，and the molecular characteristics based on cox1 and ITS genes.It provides a basis for identification and biological classification of Sitophilus zeamais，and also lays a foundation for controlling the harm of Sitophilus zeamais to grain storage.

Key words Sitophilus zeamais;Morphology observation;Molecular characteristics

基金項目 安徽省自然科學基金面上項目（1608085MC77）;安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目（gxyqZD2016171）。

作者簡介

鄒茗惠（1996—），女，江蘇徐州人，碩士研究生，研究方向：病原生物學。*通信作者，教授，博士，碩士生導師，從事病原生物的生物學與生態(tài)學研究。

鳴? 謝 該研究得到安徽師范大學生命科學院電鏡室閆浩老師大力協(xié)助。

收稿日期 2021-01-15;修回日期 2021-02-01

玉米象（Sitophilus zeamais）隸屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）有顎亞門（Mandibulata）六足總綱（Hexapoda）昆蟲綱（Insecta）有翅亞綱（Pterygota）鞘翅目（Coleoptera）象甲科（Curculionidae）谷象屬（Sitophilus），是一種世界性廣泛分布的儲糧害蟲[1]。玉米象寄生在禾谷類種子上，如蕎麥、花生仁、豆類、谷粉、面包等，以成蟲啃食或幼蟲蛀食的方式危害儲糧，主要危害貯存 2～3 年的陳糧[2]，大量發(fā)生時可引起儲糧發(fā)熱、霉變和結塊，造成儲糧的嚴重損失，影響儲糧的供給。此外，玉米象的排泄物、遺留的尸體，不僅會產生難聞的氣味，還會產生對人體有害的物質。作為一種重要的儲糧害蟲，玉米象的種群危害程度和防治一直是學者關注的重點，目前針對玉米象的研究大多集中在其生態(tài)學和防治技術上。形態(tài)鑒別是鑒定玉米象直觀的方法，也是各項生物學研究的基礎，目前對于玉米象細微結構的研究鮮見報道。分子鑒定是相較于形態(tài)鑒定更為準確和簡單的方法，其中細胞色素氧化酶亞基 I（cytochrome oxidase I，cox1）和內部轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）是鑒定物種較好的分子標記。筆者在高速度數碼顯微系統(tǒng)和掃描電鏡下觀察玉米象的外部形態(tài)和細微形態(tài)特征，然后對玉米象的cox1和ITS基因進行擴增和序列分析，為玉米象的形態(tài)學鑒定和生物學分類提供更為豐富的依據，同時為進一步開展玉米象的種群遺傳學研究、物種間系統(tǒng)進化及生物防治技術研究等提供資料。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 高速度數碼顯微系統(tǒng)（中國 KEYENCE，vw600C型），掃描電子顯微鏡（日本JEOL，JSM-6490LA型），乙醚，無水乙醇，戊二醛，氫氧化鈉，Taq PCR Master Mix，Proteinase K，DNA Polymerase和DNA marker DL 2000購于上海生物工程有限公司。

1.2 樣本采集 玉米象樣本采集于儲存時間≥1年的大米中。

1.3 方法

1.3.1 高速度數碼顯微系統(tǒng)標本制作。用零號毛筆從大米樣本中挑出玉米象，用蒸餾水溫和洗滌，置于5%氫氧化鈉溶液中消化數小時，然后用蒸餾水漂洗，依次用不同濃度的乙醇溶液進行逐級梯度脫水，整姿置于載玻片上利用高速度數碼顯微系統(tǒng)進行觀察并拍照。

1.3.2 電鏡樣本制備。將玉米象置于蒸餾水中洗凈，置2.5%戊二醛固定后，依次用不同濃度的乙醇溶液進行逐級梯度脫水，再用5%醋酸戊酯置換后，將其固定在覆蓋導電雙面膠的電鏡樣品托上，臨界點干燥后在電鏡下（5～10 kV加速電壓）進行掃描，拍照并觀察。

1.3.3 DNA提取、引物設計和PCR克隆擴增。用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）提取單頭玉米象的基因組DNA。DNA提取結束后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA質量，并用超微量核酸檢測儀檢測基因組DNA 濃度，將檢測合格的基因組 DNA 于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

cox1序列擴增引物序列如下[3]：

COIF： 5′-TCTATTCTTGGAGCTATT-3′

COIR： 5′-TAGGGACTGCAATAATTAT-3′

ITS擴增引物序列如下[4]：

ITSF：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′

ITSR：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′

引物由通用生物技術有限公司合成。所用PCR引物見表1。

PCR反應總體積為25 μL，含2.5 μL 10×Buffer、2.0? μL MgCl （2.5 mol/L）、1.5 μL dNTPs （2.5 mmol/L aech）、上下游引物（5 μmol/L）各1.0 μL、100 ng模板基因組DNA和1 U Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加無菌水補足。PCR反應參數：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。

PCR產物用1%瓊脂糖電泳和DNA 膠回收試劑盒純化后，連接到載體pMD19-T上，轉化至大腸桿菌（DH5α 感受態(tài)細胞）中，通過藍白斑篩選，將陽性克隆委托通用生物技術有限公司采用DNA 測序儀（ABI-3730）進行雙向測序。

1.3.4 測序與序列分析。目的條帶測序工作由通用生物技術有限公司完成。測定序列經過DNAMAN（6.0.3.99）軟件拼接，所得序列用DNAStar（V7.10）軟件中的EditSeq編輯，分析其堿基組成，同時利用DNAStar和DNAMAN軟件進行同源性分析并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學特征

2.1.1 玉米象在高速度數碼顯微系統(tǒng)下的形態(tài)特征。玉米象成蟲體長3.5～5.0 mm，圓筒形，紅褐色，有光澤性。前胸背板前狹后寬，上面布滿圓形刻點。后端約等于鞘翅之寬，背面刻點圓形（圖1A）。腹面可見體軀由頭、胸、腹3部分組成，胸部由3個胸節(jié)組成，有胸足3對（圖1B）。頭部額區(qū)向前伸形成啄，頭部兩側有復眼1對，復眼由多數小眼組成（圖1C）。復眼之間有1對觸角，觸角呈膝狀彎曲，由8小節(jié)組成（圖1D）。腹部由多個小節(jié)組成。雄蟲外生殖器隱藏于腹部，陽莖背面扁平，有2條平行的縱凹溝，雌蟲的Y形骨片端部較尖（圖1E、F）。玉米象背面胸腹部被鞘翅所遮擋，鞘翅的基部和端部可見明顯的2對黃色橢圓形斑紋（圖1G）。3對足形態(tài)基本相同，足上著生大量刺，最末端著生1對爪，2爪在基部愈合（圖1H）。

2.1.2 玉米象在掃描電鏡下的形態(tài)特征。

背面觀察玉米象時僅可見頭部和前胸背板，中胸、后胸和腹部常常被鞘翅所遮蓋，體表散布密集的刻點（圖2A）。

玉米象的體軀由頭、胸、腹3個部分組成，胸部由3個胸節(jié)組成，有胸足3對，其中前胸最為發(fā)達（圖2B、C）。

頭部的額和頰延伸成象鼻狀的喙，口器著生于喙端，頭部兩側有復眼1對，呈圓形突出，復眼由多數小眼組成，復眼和額之間有唇基，唇基和額之間由1條彎曲的縫分隔。復眼之間可見觸角1對（圖2D）。觸角呈現(xiàn)膝狀彎曲，包括柄節(jié)、梗節(jié)和鞭節(jié)3部分，共可見8個小節(jié)。其中，柄節(jié)有1節(jié)，呈現(xiàn)棒槌狀，粗長，與頭部接觸處有凹陷。梗節(jié)1節(jié)，鞭節(jié)可見由6個亞鞭節(jié)組成，第1～5個亞鞭節(jié)呈現(xiàn)為套筒狀，每節(jié)都像1個梯形，從第2節(jié)開始逐節(jié)變粗，第6個鞭節(jié)膨大，整體呈現(xiàn)長橢圓形，形狀類似于毛筆頭，截面近似于圓形，端部密集生長著多個感受器（圖2E）。玉米象的口器位于細長喙的端部，上唇基本退化，代之為口上片，上顎可見4個切齒，下顎須和下唇須退化而僵直，不能彎曲，外咽縫合二為一，外咽片消失（圖2F）。胸由前胸、中胸和后胸組成，前胸板呈橫形（寬大于長），前胸的后部在前足基節(jié)向后突出，嵌入中胸前方的凹陷處，兩側有溝槽，用以收納觸角（圖2B）。中胸前部窄，部分深入到前胸內，后部寬，腹面短，窄于后胸（圖2G、H）。腹部與后胸牢固相連，由10節(jié)組成。雄蟲外生殖器隱藏于腹部，來源于第9腹節(jié)，陽莖背面扁平，有2條平行的縱凹溝，是玉米象和其相近米象的主要鑒別特征（圖2I）。每一胸節(jié)腹面有足1對，稱為前足、中足和后足。3對足中，前足最小，后足最發(fā)達。足從基部到端部由6部分組成，分別為基節(jié)、轉節(jié)、腿節(jié)、脛節(jié)、跗節(jié)和爪。前足的基節(jié)可以活動，呈橫臥的圓球形（圖2J）。中足和后足的基節(jié)不明顯，活動受限（圖2K、L）。除基節(jié)外，3對足形態(tài)基本相同，轉節(jié)很小，與基節(jié)相連，腿節(jié)和轉節(jié)相連，并與轉節(jié)一起活動。腿節(jié)十分粗壯，伴有刺和齒突。脛節(jié)和腿節(jié)相連，著生大量的刺，跗節(jié)和脛節(jié)相連，由3個亞節(jié)組成，最末跗節(jié)的端部著生爪1對，2爪在基部愈合（圖2J、K、L）。

2.2 分子生物學特征 將提取到的玉米象DNA進行PCR擴增，得到清晰的cox1和ITS基因片段擴增產物（圖3），克隆擴增去掉引物后，所得cox1和ITS基因片段大小分別為441 bp（MW357434）和1 222 bp（MW356870）。

2.3 同源性和系統(tǒng)發(fā)生關系分析 在GenBank中通過Blast比對，下載19種同源性較高的象甲科象蟲cox1基因序列（表2），將該研究獲得的玉米象cox1基因片段與GenBank中已報道到的其他象甲科已知象蟲的線粒體DNA cox1 序列片段進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其與Corrêa等[5]測得的3個玉米象參考序列同源性為100%以外，與其他玉米象cox1基因序列的同源性為97.9%～99.8%。玉米象與其他幾種象蟲的同源性為78.2%～88.2%，其中與同屬于谷象屬的米象（Sitophilus oryzae）和谷象（Sitophilus gra-narius同源性最高，均為87.5 %，與北方材小蠹（Anisandrus dispar）為75.1%。同時將該研究獲得的玉米象cox1基因序列與近屬的幾種象甲科象蟲cox1序列以昆蟲綱的隆額網翅蝗 （Arcyptera coreana NC 013805.1）為外群，利用DNAMAN分析軟件構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），可見所有的玉米象（Sitophilus zeamais）聚集在同一支，同時又與米象（Sitophilus oryzae）和谷象（Sitophilus granarius）形成一個屬的分支。同樣，溝框（Eucryptorrhynchus chinensis）和臭椿溝眶象（Eucryptorrhynchus brandti）聚集在同一支，腎點毛小蠹 （Dryocoetes autographus）和北方材小蠹（Anisandrus dispar）聚集在同一支，17種象蟲最終聚集在一起，與隆額網翅蝗 （Arcyptera coreana）分開，符合形態(tài)學同一屬的分類。在GenBank中通過Blast對，下載8種同源性較高的象甲蟲ITS基因序列（表3）。同樣，將該研究獲得的玉米象ITS基因片段與GenBank中已報道到的其他象甲科已知象蟲的ITS序列片段進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其與Corrêa等[6]所測得的5個玉米象參考序列同源性分別為99.0%和99.3%、99.3%、99.1%、99.1%，和米象（Sitophilus oryzae）ITS序列的同源性為93.3%，與谷象（Sitophilus granarius）ITS序列的同源性為83.1%。同時將該研究中獲得的玉米象ITS基因序列與另外下載的8個象甲科象蟲ITS序列以松縱坑切梢小蠹蟲（Tomicus piniperda AH 011346.2）為外群，利用DNAMAN分析軟件構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），可見6個玉米象（Sitophilus zeamais）的ITS序列聚集在同一支，2個米象（Sitophilus oryzae）的ITS序列聚集在同一支，同時它們和谷象（Sitophilus granarius）形成一個屬的分支，并與松縱坑切梢小蠹蟲（Tomicus piniperda）分開。

3 討論

玉米象是儲糧的頭號大害蟲，對多種谷物和其加工物均能造成嚴重危害，在我國各省區(qū)和大多數國家和地區(qū)皆有廣泛分布。玉米象成蟲喜陰暗，趨溫、趨濕，具有假死性。耐寒力、耐饑力和產卵力都較強，發(fā)育速度快。成蟲食害禾谷類種子，以及面粉、油料、藥材等倉儲物，其中小麥、玉米、糙米及高粱受害最重;幼蟲則只在禾谷類種子內為害。

目前對玉米象整體的形態(tài)和細微形態(tài)特征的研究尚不夠全面。張生芳[10]直接在光鏡下觀察玉米象形態(tài)，并對玉米象的整體形態(tài)進行了簡單概括，提出玉米象和米象形態(tài)十分相似，僅僅可以根據外生殖器的形態(tài)差別來鑒別2種象蟲。陳帆[11]利用掃描電子顯微鏡對玉米象成蟲口器的細微形態(tài)進行了分析并與其他幾種甲蟲進行比較。數碼顯微系統(tǒng)對玉米象進行整體觀察簡單直接，可以清楚了解玉米象的外部形態(tài)整體特征，但標本的細微結構不易被觀察，借助掃描電鏡則可以清晰地觀察玉米象的細微結構特征。該研究結合掃描電鏡和高速度數碼顯微系統(tǒng)的觀察，系統(tǒng)描述了玉米象的形態(tài)特征，結果發(fā)現(xiàn)，在高速度數碼顯微系統(tǒng)的觀察下，玉米象的形態(tài)與其他研究基本相同，而在掃描電鏡下可清晰地觀察到形態(tài)的主要鑒別特征：①頭部：頭部兩側有復眼1對，呈圓形突出，復眼和額之間有唇基，唇基和額之間有1條彎曲的縫分隔。②觸角：觸角呈現(xiàn)膝狀彎曲，包括柄節(jié)、梗節(jié)和鞭節(jié)3部分，共可8個小節(jié)。其中，柄節(jié)有1節(jié)，梗節(jié)1節(jié)，鞭節(jié)可見由6個亞鞭節(jié)組成。③口器：口器位于細長喙的端部，上唇基本退化，代之為口上片，上顎可見4個切齒，下顎須和下唇須退化而僵直，不能彎曲，外咽縫合二為一，外咽片消失。④外生殖器：雄蟲外生殖器隱藏于腹部，來源于第9腹節(jié)，陽莖背面扁平，有2條平行的縱凹溝。雌蟲的Y形骨片端部較尖。該研究通過高速度數碼顯微系統(tǒng)和掃描電鏡結合觀察玉米象這些形態(tài)特征，豐富了玉米象的形態(tài)鑒定、分類等科學資料，為玉米象的控制和防治提供了有益的參考。

如其他學者的研究表明，玉米象和其同屬的米象在形態(tài)上難以鑒別，僅僅可以依靠外生殖器的形態(tài)差別進行鑒別，而分子鑒定則可以補充玉米象的形態(tài)學鑒定。分子鑒定最常用的2個分子標記為cox1和ITS，它們在動物分子鑒定以及系統(tǒng)重建過程中具有重要意義。楊瑞生等[12]克隆了3個橡實象蟲cox1基因約556 bp的片段，并與其他24種昆蟲的同源片段進行分析，研究表明利用cox1基因序列可以明顯地鑒定出橡實象蟲。王桂花[13]通過微衛(wèi)星（SSR）和線粒體cox1基因分析了福建省12個紅棕象甲地理種群的遺傳差異，更深入地了解紅棕象甲的入侵及擴散范圍，為紅棕象甲的入侵途徑和不同地理種群的防控提供理論基礎。該研究成功獲得玉米象的cox1序列片段，同時對已知10余種象甲科象蟲的cox1序列進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)所測得的玉米象cox1序列和大部分已知的玉米象參考序列同源性為100%，與在巴西和墨西哥測得的玉米象參考序列具有略微差異，可能是由于地理差距導致。玉米象與其他象蟲的同源性為75.1%～87.5%，將幾種象蟲的cox1序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)象甲科這幾種象蟲具有一定的親緣關系，同時明確可見玉米象和米象、谷象親緣關系最近，同形態(tài)學的鑒定分類結果一致。ITS是對昆蟲進行發(fā)育研究常應用的核基因。真核生物基因組中編碼核糖體的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18S rDNA和5.8S rDNA 4 種，它們在染色體上頭尾相連、串聯(lián)排列，相互之間由間隔區(qū)分隔。其中18S、5.8S和28SrDNA基因組成一個轉錄單元，三者高度保守，適合較高等級水平生物群體間的系統(tǒng)分析。該研究成功獲得玉米象的ITS基因序列。同樣，同源性分析發(fā)現(xiàn)所測得的玉米象與已知玉米象的ITS序列有略微差異，可能是來自安徽和中國臺灣、巴西的地理差異，Corrêa等[5]測得的4個巴西的玉米象ITS序列彼此之間也有略有差異，可能來自個體的差異。同時發(fā)現(xiàn)玉米象和谷象、米象ITS序列的同源為83.1%和93.3%，表明ITS可以作為種間鑒定的依據。將幾種象蟲的ITS序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確可見玉米象和米象、谷象可以聚集在同一屬，同形態(tài)學的鑒定分類結果一致。該研究測定了玉米象核基因ITS、線粒體基因cox1基因序列，可作為探討玉米象及其與其他象蟲種間系統(tǒng)進化關系的分子標記，同時可以為玉米象的防治研究提供分子基礎。

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