5種新煙堿類殺蟲(chóng)劑對(duì)休眠期和發(fā)育期紅裸須搖蚊幼蟲(chóng)的急性毒性研究

姚媛媛 龍辰 王斌 李珣 李秀仙 張冬華 閆春財(cái) 劉文彬

摘要 為了解新煙堿類殺蟲(chóng)劑對(duì)紅裸須搖蚊的毒性影響，以休眠期和發(fā)育期紅裸須搖蚊（Propsilocerus akamusi）幼蟲(chóng)為材料，測(cè)試吡蟲(chóng)啉（IMI）、噻蟲(chóng)嗪（THI）、噻蟲(chóng)胺（CLO）、呋蟲(chóng)胺（DIN）、啶蟲(chóng)脒（ACE）5種新煙堿類殺蟲(chóng)劑對(duì)幼蟲(chóng)的急性毒性差異，并探究亞致死濃度脅迫下發(fā)育期幼蟲(chóng)體長(zhǎng)和濕重的變化。結(jié)果表明，IMI、ACE和CLO毒性始終處于劇毒水平，且CLO毒性低于IMI和ACE;IMI對(duì)發(fā)育期幼蟲(chóng)毒性略高于ACE，對(duì)休眠期則相反;DIN毒性始終為高毒水平;暴露于THI下，休眠期幼蟲(chóng)耐受性顯著高于發(fā)育期幼蟲(chóng)，并且在24～96 h的持續(xù)時(shí)間內(nèi)LC50出現(xiàn)30.90～95.49倍不等的耐受性差異。IMI脅迫組體長(zhǎng)略有增長(zhǎng)，其余組均表現(xiàn)為縮短，僅ACE組出現(xiàn)顯著變化;幼蟲(chóng)濕重變化方面，IMI處理組幼蟲(chóng)濕重增長(zhǎng)顯著，均值在23.3 mg，其余組均保持在20.0 mg左右。

關(guān)鍵詞 紅裸須搖蚊;新煙堿類殺蟲(chóng)劑;休眠期;發(fā)育期;急性毒性

中圖分類號(hào) S482.3? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）20-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.001

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Acute Toxicity of Five Neonicotinoid Insecticides to the Larvae of Propsilocerus akamusi in Dormant and Developmental Phase

YAO Yuan-yuan1， LONG Chen2， WANG Bin3 et al

（1.Tianjin Natural History Museum， Tianjin 300201; 2.College of Life Sciences， Tianjin Key Laboratory of Conservation and Utilization of Animal Diversity， Tianjin Normal University， Tianjin 300387; 3.Tianjin Beidagang Wetland Nature Reserve Management Center， Tianjin 300270）

Abstract To understand the toxic effects of neonicotinoid insecticides on Propsilocerus akamusi， the larvae of Propsilocerus akamusi during the dormant and developmental phases were used as materials to test the acute toxicity difference of 5 neonicotinoid insecticides of imidacloprid （IMI）， thiamethoxam （THI）， clothianidin （CLO）， dinotefuran （DIN） and acetamiprid （ACE） to larvae，and explore the changes of body length and wet weight of larvae during developmental phase under sublethal concentration stress.The result showed that the toxicity of IMI， ACE and CLO was always at a severe level， and toxicity of CLO was lower than that of IMI and ACE.The toxicity of IMI higher than that of ACE in developmental phase， but lower in dormancy period;the toxicity of DIN was at a high level.In the case of THI，the tolerance of dormant larvae was significantly higher than that of developmental larvae， and the tolerance difference of LC50 varied from 30.90 to 95.49 times in 24-96 h.The body length of IMI stress group increased slightly， while that of the other groups decreased. Only ACE group showed significant changes. In terms of the change of larvae wet weight， the larvae wet weight of IMI treatment group increased significantly， with an average of 23.3 mg， and the rest groups maintained about 20.0 mg.

Key words Propsilocerus akamusi;Neonicotinoid insecticides;Dormant phase;Developmental phase;Acute toxicity

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（3167232 31801994）;天津市應(yīng)用基礎(chǔ)計(jì)劃項(xiàng)目（18JCQNJC14700，18JCYBJC96100）。

作者簡(jiǎn)介 姚媛媛（1987—），女，天津人，助理館員，碩士，從事動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)研究。*通信作者，講師，博士，從事動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)研究。

收稿日期 2021-02-03;修回日期 2021-03-29

搖蚊幼蟲(chóng)對(duì)水質(zhì)變化敏感，常作為評(píng)估水體質(zhì)量的重要指示生物[1]。紅裸須搖蚊，隸屬于搖蚊科直突搖蚊亞科裸須搖蚊屬，為我國(guó)北方水體的優(yōu)勢(shì)種之一[2]。近年來(lái)，我國(guó)水污染情況嚴(yán)峻，尤其在紅裸須搖蚊廣泛分布的海河流域，自2011年起水質(zhì)監(jiān)測(cè)中為Ⅴ類水質(zhì)的比例在我國(guó)大型流域一直位于較高水平[3]。一系列研究發(fā)現(xiàn)污染物對(duì)水生生物產(chǎn)生較大毒害作用，為評(píng)估多種污染物對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)，許多學(xué)者以搖蚊幼蟲(chóng)為材料開(kāi)展了毒理學(xué)研究，如Arambourou等[4]研究發(fā)現(xiàn)暴露于重金屬污染的沉積物會(huì)使搖蚊幼蟲(chóng)生長(zhǎng)和繁殖活動(dòng)受到顯著抑制;鄧萬(wàn)蓉等[5]探究菲對(duì)搖蚊幼蟲(chóng)的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)大于5 mg/kg的菲脅迫下可使搖蚊羽化時(shí)間顯著提前;Dos Santos Morais等[6]研究發(fā)現(xiàn)搖蚊暴露于亞慢性濃度鄰苯二甲酸芐基丁酯時(shí)，出現(xiàn)頭殼變窄、雄性成蟲(chóng)翅長(zhǎng)減小的現(xiàn)象，但這些研究多集中于重金屬和有機(jī)污染物，對(duì)殺蟲(chóng)劑類污染物毒性研究較少。

新煙堿類殺蟲(chóng)劑是目前生產(chǎn)中大量使用的一類殺蟲(chóng)劑，具有無(wú)交互抗性、高效和低毒等特點(diǎn)，至2011年，全球年銷售額已近20億美元，占世界殺蟲(chóng)劑1/5的市場(chǎng)份額。但由于該類殺蟲(chóng)劑的大量和不合理使用，加之其高水溶性，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題，在多國(guó)水體和土壤中檢出多種新煙堿類殺蟲(chóng)劑[7-9]。為評(píng)測(cè)該殺蟲(chóng)劑大劑量使用及外排對(duì)非靶標(biāo)生物的影響，相關(guān)毒性效應(yīng)試驗(yàn)已廣泛開(kāi)展，許多研究發(fā)現(xiàn)，該殺蟲(chóng)劑污染可通過(guò)花蜜殘留等方式對(duì)以蜜蜂為首的非靶標(biāo)生物造成較大危害[10]，對(duì)家蠶、赤眼蜂等陸生昆蟲(chóng)羽化及一系列生命活動(dòng)產(chǎn)生極不利的影響[11-13]，此外，在致毒機(jī)理等方面也已取得較大的研究進(jìn)展[14]，但這些研究一般為陸生非靶標(biāo)昆蟲(chóng)的成蟲(chóng)階段，而對(duì)水生非靶標(biāo)昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)階段的研究則鮮有開(kāi)展。

休眠和羽化為搖蚊生活史的重要階段，發(fā)育期幼蟲(chóng)受環(huán)境因子影響積累達(dá)一定閾值可誘導(dǎo)羽化過(guò)程。Zou等[15]研究發(fā)現(xiàn)，紅裸須搖蚊幼蟲(chóng)屬于狹溫性耐寒幼蟲(chóng)，在4—10月時(shí)處于休眠狀態(tài)，11—12月時(shí)出現(xiàn)顯著發(fā)育現(xiàn)象，1月開(kāi)始觀察到成蟲(chóng)出現(xiàn)。休眠和羽化過(guò)程中，昆蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)生一系列復(fù)雜基因表達(dá)和代謝變化，對(duì)環(huán)境因子抗性也相應(yīng)改變[16]，但紅裸須搖蚊對(duì)新煙堿類殺蟲(chóng)劑是否存在基于休眠過(guò)程而表現(xiàn)的抗性差異目前尚不明確。

該研究以休眠期和發(fā)育期紅裸須搖蚊幼蟲(chóng)為材料，選擇農(nóng)田使用量較廣的5種新煙堿類殺蟲(chóng)劑開(kāi)展急性毒性試驗(yàn)，為評(píng)價(jià)水體新煙堿類殺蟲(chóng)劑污染對(duì)搖蚊幼蟲(chóng)危害、探究昆蟲(chóng)休眠期抗性變化和搖蚊幼蟲(chóng)用作新煙堿類殺蟲(chóng)劑污染指示生物提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試生物

試驗(yàn)用搖蚊幼蟲(chóng)分別于紅裸須搖蚊發(fā)育期（2019年11月）和休眠期（2020年6月）購(gòu)于紅蟲(chóng)捕撈商，經(jīng)核實(shí)2批幼蟲(chóng)在潮白河同一點(diǎn)位捕撈，根據(jù)Sther[17]的研究鑒定物種為紅裸須搖蚊（Propsilocerus akamusi），根據(jù)頭殼寬度判斷齡期，使用體視鏡挑選4齡幼蟲(chóng)作為試驗(yàn)材料。

1.2 馴化處理方法

將搖蚊幼蟲(chóng)放置于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)長(zhǎng)23.5 cm、寬13.5 cm、高14.5 cm的塑料容器中，使用光照除氯的自來(lái)水馴化培養(yǎng)7 d（水溫18～23 ℃、pH 8.2、溶解氧7.7～9.6 mg/L、總硬度7.1 mmol/L），容器存放于自然光照處，馴養(yǎng)期間用氣泵進(jìn)行微曝氣，觀察到每日自然死亡幼蟲(chóng)少于2%時(shí)，即挑選活性較強(qiáng)、體型大小均一的幼蟲(chóng)進(jìn)行毒性試驗(yàn)。

1.3 供試試劑

70%吡蟲(chóng)啉（IMI），浙江威爾達(dá)化工有限公司;

25%噻蟲(chóng)嗪（THI），江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司;

30%噻蟲(chóng)胺（CLO），北京華戎生物激素廠;

70%呋蟲(chóng)胺（DIN），山東埃森化學(xué)有限公司;

70%啶蟲(chóng)脒（ACE），山東中新科農(nóng)生物科技有限公司。

劑型均為水分散粒劑，配制所需濃度時(shí)，用除氯的自來(lái)水將顆粒溶解為一定濃度的母液，再稀釋至試驗(yàn)所需濃度。

1.4 毒性試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用靜水染毒法，5種藥液試驗(yàn)濃度設(shè)定具體見(jiàn)表1。設(shè)置僅添加除氯自來(lái)水的燒杯為空白對(duì)照，將試驗(yàn)幼蟲(chóng)放入盛有100 mL藥液的燒杯中，每個(gè)處理組添加20頭，設(shè)置3組重復(fù)，試驗(yàn)過(guò)程中及時(shí)挑出死亡幼蟲(chóng)，于處理24、48、72和96 h觀察染毒現(xiàn)象并統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)，死亡標(biāo)準(zhǔn)為玻璃棒多次觸碰搖蚊幼蟲(chóng)腹部后端未觀察到身體卷曲或擺動(dòng)反應(yīng)。

1.5 體長(zhǎng)和濕重的測(cè)定

取發(fā)育期（2019年11月）幼蟲(chóng)，使用96 h亞致死濃度（96 h-LC20）藥液脅迫搖蚊幼蟲(chóng)，處理方法同“1.4”，暴露96 h后從每個(gè)處理組中隨機(jī)選取10頭搖蚊幼蟲(chóng)，使用體視鏡和電子天平測(cè)定體長(zhǎng)及濕重。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用概率單位法[18]，使用SPSS 19.0進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算半致死濃度（LC50）及其95%置信區(qū)間，設(shè)置自變量為對(duì)數(shù)藥液濃度，因變量為幼蟲(chóng)死亡概率單位，使用單因素ANOVA方差分析效應(yīng)顯著性，P值小于0.05時(shí)視為影響顯著。將分析數(shù)據(jù)總結(jié)至Excel 2019制作表格，導(dǎo)入OriginPro 2017進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性暴露下的中毒狀態(tài)

從5種新煙堿類殺蟲(chóng)劑脅迫下的中毒狀態(tài)（表2）可以觀察到中毒行為隨處理濃度增大而顯著，具體表現(xiàn)為IMI、ACE、DIN脅迫下幼蟲(chóng)均為頭尾向內(nèi)彎曲蜷縮，而THI和CLO則出現(xiàn)無(wú)規(guī)則擺動(dòng)和身形扭曲。對(duì)于體色變化，除THI脅迫下幼蟲(chóng)體色仍保持較紅外，其余4種殺蟲(chóng)劑均出現(xiàn)體色變暗的現(xiàn)象，但程度不一，DIN脅迫下體色變?yōu)榘导t色，而IMI、CLO、ACE均為棕黑色。對(duì)死亡形態(tài)，與中毒行為存在一定程度上的對(duì)應(yīng)，如出現(xiàn)向內(nèi)蜷縮行為的IMI、ACE、DIN脅迫組，最終死亡形態(tài)為“O”字型，而無(wú)規(guī)則擺動(dòng)的THI最終死亡形態(tài)為棒直狀，對(duì)于CLO，則部分呈現(xiàn)一定程度的扭曲，另一部分為棒直狀。

2.2 亞致死濃度脅迫下幼蟲(chóng)的體長(zhǎng)和濕重變化

2.2.1 體長(zhǎng)變化。

從圖1可以看出，亞致死濃度脅迫下，除IMI脅迫組體長(zhǎng)略有增長(zhǎng)，其余處理組均使搖蚊體長(zhǎng)變短，但除ACE外，影響均不顯著。對(duì)箱體所示范圍，除IMI處理組使個(gè)體差異略有增大，其余各組均使組內(nèi)個(gè)體差異減小。

2.2.2 濕重變化。

從新煙堿類殺蟲(chóng)劑處理下的濕重變化（圖2）可以看出，IMI處理組濕重增大顯著，均值在23.3 mg，其余處理組及對(duì)照組均保持在20.0 mg左右。IMI、THI和ACE處理組內(nèi)差異個(gè)體變大，而CLO和DIN處理組內(nèi)差異與對(duì)照組接近。

2.3 新煙堿類殺蟲(chóng)劑對(duì)不同發(fā)育時(shí)期紅裸須搖蚊幼蟲(chóng)的急性毒性差異

5種新煙堿類殺蟲(chóng)劑對(duì)不同時(shí)期紅裸須搖蚊幼蟲(chóng)的急性毒性如表3和表4所示，R2表明采用了線性回歸分析的毒力回歸方程擬合效果較好。總體上，5種新煙堿類殺蟲(chóng)劑隨作用時(shí)間增長(zhǎng)，對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲(chóng)的LC50均下降，以LC50為依據(jù)分析，對(duì)發(fā)育期幼蟲(chóng)毒性由大到小依次為IMI、ACE、THI、CLO和DIN，而對(duì)休眠期幼蟲(chóng)毒性由大到小依次為ACE、IMI、CLO、DIN和THI。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定外來(lái)污染物的急性毒性等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（表5）評(píng)價(jià)5種殺蟲(chóng)劑急性毒性等級(jí)，結(jié)果顯示，對(duì)發(fā)育期幼蟲(chóng)，除DIN為高毒外，其余殺蟲(chóng)劑均為劇毒，而對(duì)休眠期幼蟲(chóng)，DIN和THI均為高毒，其余為劇毒，表明水體新煙堿類殺蟲(chóng)劑對(duì)紅裸須搖蚊幼蟲(chóng)毒性較大，且對(duì)不同發(fā)育時(shí)期幼蟲(chóng)毒性存在差異，具體表現(xiàn)為：對(duì)IMI和THI，在96 h內(nèi)休眠期幼蟲(chóng)的耐受性均高于發(fā)育期;而對(duì)于CLO、DIN和ACE，在24 h內(nèi)休眠期幼蟲(chóng)耐受性高，24h后則為發(fā)育期幼蟲(chóng)耐受性較高。需要特別指出，對(duì)于THI脅迫，相較于發(fā)育期，休眠期幼蟲(chóng)在24 h內(nèi)耐受性高出94.49倍，96 h時(shí)高出29.90倍，耐受性差異顯著;而對(duì)其他幾種殺蟲(chóng)劑，耐受性差異均在0.72～1.51倍。此外，同一處理組在24～96 h下休眠期與發(fā)育期的LC50差異倍數(shù)在2.35～13.80倍，表明在半致死效應(yīng)下，毒性的劑量對(duì)染毒時(shí)間的依賴程度存在較大差異。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)以休眠期和發(fā)育期紅裸須搖蚊（Propsilocerus akamusi）4齡幼蟲(chóng)為材料，探究5種新煙堿類殺蟲(chóng)劑對(duì)不同發(fā)育時(shí)期幼蟲(chóng)的急性毒性差異，結(jié)果顯示，在5種殺蟲(chóng)劑中，吡蟲(chóng)啉（IMI）、啶蟲(chóng)脒（ACE）和噻蟲(chóng)胺（CLO）毒性始終處于劇毒水平，且發(fā)育期IMI毒性略高于ACE，休眠期則相反，但CLO毒性始終低于IMI和ACE。呋蟲(chóng)胺（DIN）毒性始終為高毒水平，且不同發(fā)育期毒性差異較小。而對(duì)于噻蟲(chóng)嗪（THI），休眠期幼蟲(chóng)耐受性顯著高于發(fā)育期幼蟲(chóng)，在24～96 h的持續(xù)時(shí)間內(nèi)LC50出現(xiàn)30.90～95.49倍不等的差異。

吡蟲(chóng)啉為目前農(nóng)田使用量最大的新煙堿類殺蟲(chóng)劑，為科學(xué)制定該類殺蟲(chóng)劑排放標(biāo)準(zhǔn)，該試驗(yàn)使用4齡紅裸須搖蚊幼蟲(chóng)對(duì)其進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明，吡蟲(chóng)啉對(duì)4齡紅裸須搖蚊幼蟲(chóng)的24 h-LC50、48 h-LC50、96 h-LC50分別為27.21、19.27、12.71 μg/L。該結(jié)果與其他種搖蚊幼蟲(chóng)相比，抗性差異不大，如Njattuvetty Chandran等[19]用吡蟲(chóng)啉對(duì)1齡溪流搖蚊（Chironomus riparius）幼蟲(chóng)脅迫得出24 h-LC50為31.5 μg/L，Azevedo-Pereira等[20]用2齡溪流搖蚊幼蟲(chóng)試驗(yàn)得出48 h-LC50為19.9 μg/L，Pestana等[21]用2齡溪流搖蚊幼蟲(chóng)試驗(yàn)得出96 h-LC50為12.94 μg/L。比較發(fā)現(xiàn)，紅裸須搖蚊在吡蟲(chóng)啉抗性上與溪流搖蚊無(wú)顯著差異。另有研究對(duì)3齡的伸展搖蚊幼蟲(chóng)（Chironomus tentans）進(jìn)行吡蟲(chóng)啉暴露，算得96 h-LC50為5.75 μg/L[22]。而近年來(lái)，稀疏搖蚊（Chironomus dilutus）幼蟲(chóng)也逐漸進(jìn)入國(guó)內(nèi)外毒理學(xué)學(xué)者視野，一系列試驗(yàn)結(jié)果顯示吡蟲(chóng)啉對(duì)2齡幼蟲(chóng)96 h-LC50為4.63 μg/L[23]、3齡幼蟲(chóng)96 h-LC50為2.65 μg/L[24]和11.8 μg/L[25]，試驗(yàn)結(jié)果存在一定差異，其原因在于不同學(xué)者使用的毒性暴露方式和前處理?xiàng)l件不同，但總體上紅裸須搖蚊對(duì)吡蟲(chóng)啉抗性略高于稀疏搖蚊。

而吡蟲(chóng)啉對(duì)其他水生生物的急性毒性試驗(yàn)已有大量學(xué)者完成，如大型溞[26]、斑馬魚(yú)[27-29]、澤蛙蝌蚪[30]、鯉魚(yú)[31]、日本沼蝦[31]、克氏原螯蝦[32]等，總結(jié)如下：大型溞48 h-LC50為5.02 mg/L;斑馬魚(yú)96 h-LC50為281.37 mg/L;澤蛙蝌蚪24、48、72、96 h的LC50分別為365.9、307.7、257.1和217.9 mg/L;鯉魚(yú)24、48、72、96 h的LC50分別為208.3、138.8、108.9和96.4 mg/L;日本沼蝦24和48 h的LC50分別為88.5和34.8 μg/L;克氏原螯蝦96 h-LC50為10.98 mg/L。總體上看，耐受性斑馬魚(yú)>澤蛙蝌蚪>鯉魚(yú)>克氏原螯蝦>大型溞>日本沼蝦>搖蚊幼蟲(chóng)，其中，吡蟲(chóng)啉對(duì)搖蚊幼蟲(chóng)和日本沼蝦達(dá)到劇毒評(píng)級(jí)，大型溞接近中毒，而克氏原螯蝦、斑馬魚(yú)、澤蛙蝌蚪和鯉魚(yú)均為微毒。

對(duì)其余幾種新煙堿類殺蟲(chóng)劑，有學(xué)者研究稀疏搖蚊（Chironomus dilutus）2齡幼蟲(chóng)對(duì)噻蟲(chóng)胺和噻蟲(chóng)嗪的96 h-LC50分別為5.93和55.34 μg/L[23]。Raby等[25]研究了多種新煙堿類對(duì)3齡稀疏搖蚊幼蟲(chóng)的96 h-LC50分別為啶蟲(chóng)脒2.8 μg/L、噻蟲(chóng)胺11.6 μg/L、呋蟲(chóng)胺23.5 μg/L、吡蟲(chóng)啉11.8 μg/L、噻蟲(chóng)嗪61.9 μg/L。與該試驗(yàn)結(jié)果相比，紅裸須搖蚊對(duì)呋蟲(chóng)胺抗性高，但對(duì)噻蟲(chóng)嗪抗性較低。

盡管近10年多種新煙堿類殺蟲(chóng)劑的污染受到毒理學(xué)學(xué)者持續(xù)關(guān)注，但對(duì)除吡蟲(chóng)啉以外的新煙堿類殺蟲(chóng)劑研究仍較少，近年來(lái)我國(guó)噻蟲(chóng)嗪僅有對(duì)中華蟾蜍蝌蚪[33]、斑馬魚(yú)[27]等研究;啶蟲(chóng)脒僅有對(duì)大型溞[26]、斑馬魚(yú)[29]、虎紋蛙蝌蚪[34]、中華蟾蜍蝌蚪[35]等研究;呋蟲(chóng)胺僅有對(duì)斑馬魚(yú)[36]等研究;噻蟲(chóng)胺僅有對(duì)大型溞[27]等研究。在殺蟲(chóng)劑市場(chǎng)多元化的大趨勢(shì)下，多種污染物并存的情況愈發(fā)常見(jiàn)，在這個(gè)沉重的背景下，為科學(xué)衡量污染物含量與毒性關(guān)系，合理制定相關(guān)排放標(biāo)準(zhǔn)，毒理學(xué)的研究已刻不容緩。

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