響應(yīng)面法優(yōu)化β-環(huán)糊精輔助提取水飛薊賓工藝

劉芳，瞿曉梅，趙婷，李紫嫣，劉玉璇，國大亮

天津中醫(yī)藥大學（天津 301617）

水飛薊Silybum marianum（L.）是一種菊科水飛薊屬1年生或2年生草本植物[1-3]，水飛薊素是從水飛薊果實中提取出來的一種黃酮類物質(zhì)，主要成分為水飛薊賓[4-6]。其具有保肝[7-10]、抗癌[11-12]、抗菌[13]、抗血小板聚集[14]、抗炎和抗氧化[15]等藥理作用。水飛薊果實不僅具有較高的藥用價值，其營養(yǎng)價值也很高，將水飛薊賓加入到各種食品或飲料，制成保健食品或飲料，拓寬了水飛薊賓的應(yīng)用范圍[16]。

β-環(huán)糊精（β-CD）具有外親水內(nèi)疏水的特殊結(jié)構(gòu)，能夠選擇性包合難溶的藥物成分，通過增加其溶解度提高中藥有效成分的提取率[17]，在中藥提取工藝上有著潛在的優(yōu)勢，因此得到越來越廣泛的應(yīng)用[18]。從水飛薊中提取水飛薊賓是此中藥開發(fā)利用的重要環(huán)節(jié)，目前水飛薊賓的提取方式有超聲輔助有機溶劑提取[19-20]，堿提酸沉法[21]，超聲輔助雙水相體系提取[22]。試驗通過β-CD輔助提取提高水飛薊賓的提取率，以期在后續(xù)食品開發(fā)和工業(yè)生產(chǎn)中提供理論依據(jù)。

響應(yīng)面法是利用中心組合試驗擬合出二次多項式模型，通過回歸分析尋找最優(yōu)工藝參數(shù)[23]。試驗以水飛薊果實為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化試驗得出最佳提取工藝條件，從而提高水飛薊賓得率。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與設(shè)備

Series III高效液相色譜儀（美國實驗儀器公司）；UV-6100紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-DⅢ循環(huán)水浴真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

1.2 試驗材料與試劑

水飛薊賓對照品（≥98%，ChemFaces）；水飛薊籽（安國市聚藥堂藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號2008001）；β-環(huán)糊精[中國醫(yī)藥（集團）上海化學試劑公司]；甲醇（色譜純，SIGMA-ALDRICH）、冰醋酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 水飛薊賓含量測定分析方法的建立

1.3.1.1 含量測定方法

1.3.1.1.1 色譜條件的確定

色譜柱Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm）；流動相為甲醇-水-冰醋酸=48∶52∶1（V/V）；流速1 mL/min；檢測波長287 nm；柱溫采用室溫[24]。

1.3.1.1.2 標準溶液的配制

精密稱取10.08 mg水飛薊賓對照品，置于50 mL容量瓶中加甲醇溶解制備成質(zhì)量濃度0.201 6 mg/mL的標準儲備液。

1.3.1.1.3 供試品溶液的配制

精密稱取水飛薊賓提取物，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲使其充分溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3.1.1.4 紫外最大吸收波長的選擇

以標準儲備液為母液，精密吸取5 mL，置于10 mL容量瓶中，加色譜甲醇稀釋至刻度，在200~400 nm進行全波長掃描。

1.3.1.2 含量測定方法學考察

1.3.1.2.1 線性關(guān)系考察

精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和5.0 mL水飛薊賓對照品溶液，置10 mL量瓶中，加色譜甲醇稀釋至刻度，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按上述色譜條件進樣測定。以峰面積y為縱坐標，濃度x為橫坐標，進行線性回歸，其回歸方程為y=8 816.4x-9 505，R2=0.999 1。

1.3.1.2.2 精密度考察

取20 μL同一對照品溶液，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，水飛薊賓對照品溶液SRSD=2.34%，表明高效液相儀器精密度良好。

1.3.1.2.3 穩(wěn)定性考察

取同一份供試品溶液，分別于樣品制備后0，2，4，6，12和24 h進樣分析，SRSD=2.72%，說明穩(wěn)定性良好，供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.1.2.4 重復(fù)性考察

按照供試品溶液的配制方法，平行制備6份供試品溶液，注入高效液相色譜儀進樣分析，SRSD=1.96%，表示重復(fù)性良好。

1.3.1.2.5 加樣回收率考察

精密稱取6份已知含量的供試品，按水飛薊賓已知量的1倍加入對照品，同法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，計算加樣回收率。

結(jié)果顯示，水飛薊賓對照品溶液平均回收率為100.4%，SRSD為1.65%，說明高相液相檢測方法所測加樣回收率結(jié)果可靠。

表1 水飛薊賓加樣回收率結(jié)果

1.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化水飛薊賓提取工藝

1.3.2.1 水飛薊賓的提取

將完整的水飛薊籽粉碎過篩，加入一定量的β-環(huán)糊精，與一定量的溶劑混勻，在水浴鍋上加熱回流，將提取液過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。

1.3.2.2 單因素試驗

選取乙醇體積分數(shù)、料液比、β-環(huán)糊精加入量、提取時間4個因素作為自變量，水飛薊賓提取量作為響應(yīng)值。各因素的水平梯度設(shè)置：乙醇體積分數(shù)為0，30%，50%，70%和90%；料液比為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）；β-環(huán)糊精加入量為0，5%，10%，15%和20%；提取時間為1，2，3，4和5 h。根據(jù)試驗結(jié)果選擇主要影響因素，根據(jù)響應(yīng)面法設(shè)計水飛薊賓提取工藝，建立最優(yōu)工藝。

1.3.2.3 Box-Behnken試驗設(shè)計

在已有試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)各因素對提取工藝的影響，選取料液比、β-環(huán)糊精加入量、提取時間為自變量，以水飛薊賓提取量為評價指標進行星點設(shè)計試驗，采用Design Expert試驗設(shè)計軟件進行試驗。采用二次多項式擬合，建立方程式，根據(jù)最佳模型描繪響應(yīng)面。試驗因素及各水平值見表2。

表2 水飛薊賓提取工藝響應(yīng)面試驗因素與水平

1.3.2.4 最優(yōu)處方驗證

根據(jù)Design Expert軟件所給出的最優(yōu)提取工藝預(yù)測各因素的最優(yōu)值，測定水飛薊賓提取量，與軟件所給出的預(yù)測值對比，驗證軟件的準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外最大吸收波長的選擇

水飛薊賓對照品在200~400 nm進行全波長掃描，結(jié)果在287 nm處有最大吸收，故選擇287 nm為測定波長。

圖1 水飛薊賓全波長掃描圖

2.2 HPLC色譜圖（見圖2）

圖2 HPLC色譜圖

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 乙醇體積分數(shù)對水飛薊賓提取量的影響

由圖3可知，隨著乙醇體積分數(shù)增大，水飛薊賓提取量隨之增加，乙醇體積分數(shù)70%達到最大，乙醇濃度繼續(xù)增大，水飛薊賓提取量反而減小，可能是因為乙醇體積分數(shù)70%時，提取出的水飛薊賓量達到飽和，繼續(xù)增大乙醇濃度會將其他成分一并提取出來，造成水飛薊賓提取量降低。因此，選擇體積分數(shù)70%乙醇作為提取溶劑。

圖3 體積分數(shù)對水飛薊賓提取量的影響

2.3.2 料液比對水飛薊賓提取量的影響

由圖4可知，隨著料液比增加，水飛薊賓提取量隨著增大，料液比1∶15（g/mL）時提取量達到最大，料液比繼續(xù)增大，水飛薊賓提取量反而減小，可能是隨著料液比增加，其他水溶性物質(zhì)也隨著提取出來，造成水飛薊賓提取量降低。所以，料液比選擇1∶15（g/mL）作為響應(yīng)面試驗的中心點。

圖4 料液比對水飛薊賓提取量的影響

2.3.3β-環(huán)糊精加入量對水飛薊賓提取量的影響

由圖5可知，隨著β-環(huán)糊精增加，水飛薊賓提取量隨之增加，β-環(huán)糊精加入量10%時提取量達到最大，隨著β-環(huán)糊精繼續(xù)加入，水飛薊賓提取量降低?？赡苁怯捎讦?環(huán)糊精的包合作用。故選擇β-環(huán)糊精加入量10%作為中心點進行響應(yīng)面試驗。

圖5 β-環(huán)糊精加入量對水飛薊賓提取量的影響

2.3.4 提取時間對水飛薊賓提取量的影響

由圖6可知，隨著提取時間延長，水飛薊賓提取量隨之增大，提取時間3 h時水飛薊賓提取量達到最大，隨著提取時間繼續(xù)延長，水飛薊賓的提取量反而降低，可能是隨著時間延長，水飛薊賓發(fā)生分解或提取出其他黃酮類物質(zhì)造成提取量降低。故選擇3 h作為提取時間中心點進行響應(yīng)面試驗。

圖6 提取時間對水飛薊賓提取量的影響

2.4 水飛薊賓的提取工藝優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果

運用Design-Expert 8.0.6對表3中試驗結(jié)果進行多元線性回歸及二項式擬合，得到二項式擬合方程：水飛薊賓提取量=6.42+0.15A+0.29B+0.036C+0.24AB+0.60AC+0.12BC-0.87A2-1.14B2-0.20C2。

表3 水飛薊賓提取工藝優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果

由表4可知，該模型p=0.000 1＜0.05，失擬項p=0.494 7＞0.05，說明該回歸方程擬合性、可信度良好，顯著性高，各試驗點均能以模型描述。R2=0.986 4說明試驗數(shù)據(jù)與模型相關(guān)性好，可用回歸方程對水飛薊賓的提取工藝過程進行預(yù)測和分析。分析各因素影響顯著性發(fā)現(xiàn)，一次項C及交互項BC不顯著，一次項A、B及交互項AB、AC，二次項A2、B2、C2均顯著說明試驗?zāi)Ｐ筒皇呛唵蔚木€性關(guān)系，適合應(yīng)用星點-響應(yīng)面進行分析優(yōu)化。

表4 回歸方程方差分析

2.4.2 各因素交互作用響應(yīng)面圖（見圖7~圖9）

圖7 料液比與β-環(huán)糊精加入量對水飛薊賓提取量影響的等高線圖與響應(yīng)面圖

圖8 料液比與提取時間對水飛薊賓提取量影響的等高線圖與響應(yīng)面圖

圖9 β-環(huán)糊精加入量與提取時間對水飛薊賓提取量影響的等高線圖與響應(yīng)面圖

2.4.3 提取工藝條件優(yōu)化預(yù)測

運用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化所得的水飛薊賓最優(yōu)提取工藝預(yù)測為料液比1∶16.8（g/mL）、β-環(huán)糊精加入量11%、提取時間3.7 h。在此條件下預(yù)測水飛薊賓含量為6.49 mg。

2.5 驗證試驗

按照響應(yīng)面優(yōu)化的最優(yōu)條件進行驗證試驗，在其他因素固定不變的條件下，按照響應(yīng)面軟件所得到的最優(yōu)提取工藝提取水飛薊賓，測定的水飛薊賓提取量依次為6.37，6.58和6.28 mg/g。水飛薊賓提取量的預(yù)測值和實測值的相對誤差在1.2%，說明試驗所得數(shù)學模型可以較好的預(yù)測各因素和評價指標之間的關(guān)系，適用于該水飛薊賓提取量的提取工藝優(yōu)化。

3 結(jié)論

試驗通過星點-響應(yīng)面法優(yōu)化β-環(huán)糊精輔助提取水飛薊賓的工藝研究，運用Design-Expert對數(shù)據(jù)進行擬合，建立各影響因素與響應(yīng)值的數(shù)學模型。確定的最優(yōu)提取條件為料液比1∶16.8（g/mL）、β-環(huán)糊精加入量11%、提取時間3.7 h。最佳提取條件下預(yù)測水飛薊賓提取量為6.49 mg/g。實測值與理論值總體吻合，說明模型能較好的預(yù)測響應(yīng)值，優(yōu)化條件可靠，具有實際應(yīng)用價值。試驗表明，β-環(huán)糊精能顯著提高水飛薊賓提取率，為后續(xù)水飛薊賓的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。