鄰苯二甲酸酯對電活性生物膜性能潛在影響機制

董 躍，蔣奕穎，隋明銳，彭 飛

(1.河海大學淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室，江蘇 南京 210098；2.河海大學環(huán)境學院，江蘇 南京 210098；3.河海大學水利水電學院，江蘇 南京 210098)

隨著我國社會的不斷進步和發(fā)展，城市化水平的不斷提高，水體氮磷超標[1]、生物毒性物質(zhì)增加[2]、藻類暴發(fā)式增長[3]等水污染問題越來越引起人們的重視，其中，塑料制品在各個行業(yè)中的廣泛使用導致難降解的增塑劑大量進入市政廢水處理廠，對現(xiàn)有的生物處理系統(tǒng)產(chǎn)生了一定的沖擊。鄰苯二甲酸酯(phthalate esters，PAEs)類塑化劑是一類用于提高產(chǎn)品強度的增塑材料，極易從塑料主體遷移至水環(huán)境中，對人體健康和生態(tài)環(huán)境造成巨大的威脅[4]。以電活性生物膜(electroactive biofilms，EABs)為主體的微生物電化學系統(tǒng)(MES)具有可回收生物質(zhì)能和高效降解污染物的特點[5]，在市政廢水能源化處理領(lǐng)域備受關(guān)注。EABs被定義為能夠與導電表面交換電子的生物膜，其性能受胞外電子傳遞過程的影響[6]。而這一生化過程反應(yīng)復雜，常見的影響因素有電極材料的差異、有毒物質(zhì)的沖擊、酶活性的變化等。因此市政廢水中的毒害物質(zhì)會通過影響EABs的生理、生化行為以降低MES的處理效率。目前，PAEs作為一種新出現(xiàn)的污染物，對EABs性能的影響機制尚未探明。本文通過總結(jié)典型毒害物質(zhì)對生物膜的影響機制，推測PAEs對EABs性能的潛在影響機制。

1 PAEs概述

PAEs俗稱酞酸酯，常作為工業(yè)塑料、樹脂和橡膠類制品的增塑劑，是一類重要的環(huán)境激素類化合物，在環(huán)境中性質(zhì)穩(wěn)定，存留時間長，有較強的生物蓄積毒性，在塑料中的添加量高達20%～50%[7]，被稱為第2個全球性“PCB污染物”[8]。PAEs一般為無色油狀黏稠液體，具有一定的流動性、揮發(fā)性和可燃性。這類化合物主要有鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丙酯(DPrP)、鄰苯二甲酸二正戊酯(DPP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)等，其中DBP和DEHP在環(huán)境中最為常見。PAEs的化學性質(zhì)穩(wěn)定，物理和化學作用的降解速率非常緩慢，決定了其進入環(huán)境后將穩(wěn)定賦存，并持久性地影響生物處理系統(tǒng)的穩(wěn)定性[9]。

1.1 PAEs在環(huán)境中的運移

大量塑料制品老化造成的持續(xù)釋放是PAEs在環(huán)境介質(zhì)中廣泛賦存的主要原因[10]。塑料制品的揮發(fā)以及工業(yè)生產(chǎn)中垃圾的焚燒等使PAEs釋放到空氣中，一部分通過吸附于空氣中的顆粒物而形成氣溶膠，另一部分以蒸汽的狀態(tài)存在于空氣中。這些PAEs隨大氣循環(huán)而發(fā)生長距離遷移，并通過重力沉降作用進入水體。土壤中的PAEs一部分可以被植物所吸附，另一部分會通過地表徑流、下滲、地下徑流等途徑流入水體。此外，塑料制品經(jīng)雨水淋洗及未經(jīng)處理的塑料工業(yè)廢水排放是水體中PAEs的直接來源。通過間接途徑和直接途徑，PAEs已廣泛存在于水環(huán)境中，造成其污染程度愈發(fā)嚴重[11]。在外界環(huán)境的作用下，水體中的PAEs不斷發(fā)生著水解、吸附、光解、揮發(fā)、氧化、生物降解等物理和生物變化，還會通過懸浮顆?；虻啄辔阶饔枚坏讞锛棒~類攝食，沿食物鏈不斷傳遞，通過生物放大作用最終對高營養(yǎng)級的生物產(chǎn)生一定危害(圖1)。

圖1 PAEs在環(huán)境中的運移路徑Fig.1 Migration path of PAEs in environment

1.2 水體中PAEs的賦存現(xiàn)狀

目前，我國地表水體中檢測出大量的PAEs，含量為μg/L級[12]。劉成等[13]在對膠州灣水體PAEs的污染特征和生態(tài)風險進行研究和評估時發(fā)現(xiàn)，PAEs已成為膠州灣具有潛在威脅的一類有機污染物，并且呈季節(jié)性變化趨勢。魯翌[14]調(diào)查了長江、漢江武漢段水源水和飲用水中PAEs的賦存狀態(tài)，并考察了臭氧-活性炭等深度水處理工藝對PAEs的去除情況，結(jié)果表明，水源水和飲用水中PAEs類物質(zhì)普遍存在，而現(xiàn)有的自來水處理技術(shù)包括常規(guī)水和深度水處理技術(shù)，均難以將其徹底去除。市政污水作為PAEs等污染物主要的庫和源[15]，排放后加劇了地表水體的污染程度。

不同地區(qū)、排放源、季節(jié)、人口密度、豐/枯水期、廢水處理工藝等都會使水體中PAEs的質(zhì)量濃度產(chǎn)生較大的變化和差異。表1為我國部分地區(qū)地表水及污水處理廠進水中PAEs類物質(zhì)的平均質(zhì)量濃度，可以看出大部分地區(qū)污水處理廠每日進水中PAEs類物質(zhì)平均負荷水平較高，且人口密度、經(jīng)濟發(fā)展水平越高的地區(qū)負荷越大[15-33]。

表1 我國部分地區(qū)地表水及污水處理廠進水中PAEs類物質(zhì)的平均質(zhì)量濃度

2 面向市政廢水處理的EABs簡介

EABs是能夠進行胞外電子傳遞的微生物被其分泌的胞外聚合物(extracellular polymer substances，EPS)包裹所形成的細菌聚集體。EABs的最重要特征就是具有獨特的電子傳遞方式，即在代謝過程中，將有機物產(chǎn)生的電子直接或者間接傳遞給電極，或者能夠接受電極產(chǎn)生的電子以滿足自身代謝所需?；谏鲜鎏攸c，EABs在市政廢水能源化處理領(lǐng)域受到廣泛重視。

2.1 形成過程

EABs的動態(tài)形成過程(圖2)主要包括定殖、增殖、成熟、演替4個階段[34]。微生物首先通過靜電排斥或者范德華吸引力與導電界面發(fā)生接觸，產(chǎn)生初步定殖。這種初步定殖過程主要受導電界面材料特性及電性質(zhì)影響，此階段缺乏成熟的生物膜結(jié)構(gòu)，微生物抗性不強，形成微生物菌落，并融合成生物膜的基底層。初級生物膜定殖后，微生物大量分泌EPS，將單個微生物相互連接形成團塊狀微生物菌落。合適的電位條件有助于電活性微生物的快速增殖，例如由G.sulfurreducens形成的EABs在0.2 V(相對Ag/AgCl)電位下產(chǎn)生的最大電流是0 V時的6倍[35]，意味著電活性微生物在合適電位下可以快速富集。當電活性微生物覆蓋導電界面后，會繼續(xù)分泌蛋白質(zhì)、多糖、核酸等物質(zhì)，形成更加復雜的EPS網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)。一方面，這樣的網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)可以為電活性微生物提供屏障，使其免受外部毒物干擾；另一方面，電活性微生物可以借助EPS中的蛋白質(zhì)等導電成分進行電子的轉(zhuǎn)移。成熟生物膜會隨著底物條件、水力剪切、溶解氧等外界因素變化而逐漸發(fā)生演替，并進一步對生物膜的電活性產(chǎn)生影響。如當EABs厚度為10 μm時，生物膜的電活性最強，隨著生物膜進一步加厚，電活性顯著下降[36]。

圖2 EABs的形成過程Fig.2 Formation process of electrochemically active biofilms

2.2 電活性生物膜影響因素

a.電化學因素。陽極電位對生物膜的性能有重要的影響。研究表明，電活性微生物在極化電位為-0.15 V和+0.37 V(-0.03 V相對SHE)的條件下產(chǎn)生的電流比未經(jīng)極化時提高了17倍，同時在+0.37 V電極表面生物膜中觀察到大量電子中介體[37]，推測EABs內(nèi)部電子傳遞效率的提高與EABs的EPS結(jié)構(gòu)和成分的變化有關(guān)。此外，EABs群落結(jié)構(gòu)也是影響其性能的重要因素。Malvankar等[38]的研究發(fā)現(xiàn)了不同種群組成生物膜的電活性存在顯著差異，而高導電性的生物膜能夠減小電子在生物膜內(nèi)的傳遞阻力，進而產(chǎn)生更大的電流密度。值得注意的是，pH值、溫度、電極材質(zhì)等理化條件也會通過影響電活性微生物的代謝活性而影響EABs的電活性[39-40]。

b.毒害物質(zhì)。EABs中微生物的生長代謝會受有機毒物和無機毒物的影響[41-43]。Dvila等[41]發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定運行的MFC中加入4%的甲醛后，系統(tǒng)電壓迅速從550 mV降到200 mV以下且EABs遭到不可逆的破壞；胡亞萍[44]發(fā)現(xiàn)EABs對偶氮染料廢水中的主要物質(zhì)茜素黃R有顯著的脫色作用，通過外加電壓等手段可以有效保持EABs的活性，促進茜黃素R的穩(wěn)定脫色；Tandukar等[45]發(fā)現(xiàn)電活性微生物對Cr6+的最大耐受質(zhì)量濃度為80 mg/L，超過該值后Cr6+的還原速率變得非常緩慢，EABs受到重金屬離子的沖擊，這也表明了毒性強烈的物質(zhì)容易對EABs造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，進而影響系統(tǒng)效能。實際上，不同的毒害物質(zhì)對EABs造成影響的作用機制不同，且不局限于抑制作用，甚至同一種毒害物質(zhì)在不同的研究中具有相反的作用效果[46-47]。

3 PAEs等毒害物質(zhì)對生物膜的影響機制

生物膜是一種由細菌細胞、EPS和其他非生物物質(zhì)組成的復雜的微生態(tài)系統(tǒng)，其形成是微生物之間相互作用和群體行為的結(jié)果。生物膜在自然水體的凈化和市政污水的處理中扮演著重要角色，通過吸附、吸收及生物代謝等作用來降解水體中的污染物，從而改善水質(zhì)。目前關(guān)于PAEs等毒害物質(zhì)對EABs影響機制的研究很少，但PAEs對生物膜的抑制作用已受到諸多關(guān)注。EABs是生物膜中一種特殊的類型，開展PAEs類物質(zhì)對EABs的潛在影響機制研究，首先需要科學認識PAEs等毒害物質(zhì)對生物膜結(jié)構(gòu)和功能的影響。目前的研究主要聚焦于PAEs等毒害物質(zhì)對生物膜結(jié)構(gòu)的改變和微生物活性的抑制[48]。

3.1 對生物膜結(jié)構(gòu)的影響

生物膜結(jié)構(gòu)是高度分層的，垂向分層上的膜密度和微生物類型會隨著發(fā)育過程發(fā)生漸變，而毒害物質(zhì)能夠顯著改變生物膜發(fā)育的正常進程。Shen等[49]在研究Cu2+對生物膜的影響時發(fā)現(xiàn)，暴露于5 mg/L和7 mg/L的Cu2+溶液中的生物膜厚度分別為100 μm和200 μm，后者與空白對照組相比膜密度增加了380 g/L可揮發(fā)性懸浮物。該結(jié)果說明環(huán)境毒害物質(zhì)的刺激會誘導生物膜中EPS的快速積累和聚集，生物膜結(jié)構(gòu)因此發(fā)生改變，且在一定濃度范圍內(nèi)，濃度越高，響應(yīng)越明顯(圖3)。Hu等[50]在研究低濃度芳香族污染物對生物膜的作用時發(fā)現(xiàn)，在0～60 mg/L的低濃度有毒芳烴刺激下，生物膜分泌的EPS量增加，形成致密的保護層，且分泌量與污染物濃度呈線性正相關(guān)。由此可見，一定濃度的毒害物質(zhì)會刺激生物膜分泌更多的EPS，形成致密的保護層來抵御不良環(huán)境的威脅。陶月[51]在研究DBP對生物膜發(fā)育過程中EPS的形態(tài)結(jié)構(gòu)影響時發(fā)現(xiàn)，微生物受DBP毒性影響活性下降，EPS分泌減少，其中多糖含量在對數(shù)生長期最高且高于對照組，穩(wěn)定期最低并低于對照組；蛋白質(zhì)含量隨培養(yǎng)時間延長先升高后降低，且均低于對照組，EPS中多糖/蛋白質(zhì)比值呈升高趨勢。該結(jié)果表明，DBP通過抑制生物膜分泌EPS來降低生物膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使微生物無法抵抗外部環(huán)境刺激而進一步受損甚至死亡，而EPS中多糖和蛋白質(zhì)含量的變化是否為生物膜應(yīng)對毒性刺激的響應(yīng)機制需要進一步的研究。此外，成熟的生物膜表面鑲嵌著大量的疏水性結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白質(zhì)能夠吸附DEHP，使得DEHP與大量EPS相互交織，共同構(gòu)成了生物膜的基本骨架[52]，由此可知，PAEs等毒害物質(zhì)引起生物膜結(jié)構(gòu)的改變是通過EPS的含量和成分變化實現(xiàn)的。EPS作為生物膜結(jié)構(gòu)的骨架，其具有的分泌和黏結(jié)作用對生物膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定形成非常重要[53-54]。該作用可以幫助微生物對抗外界環(huán)境的干擾，并實現(xiàn)微生物之間的物質(zhì)和能量交換，是生物膜響應(yīng)毒害物質(zhì)攻擊的一種自我保護機制。

圖3 毒害物質(zhì)對生物膜結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Influence of toxic substances on structure of biofilms

3.2 對生物膜細菌活性的影響

細菌作為生物膜的主體，與生物膜功能的發(fā)揮密切相關(guān)。目前，許多研究表明環(huán)境毒害物質(zhì)會對生物膜內(nèi)微生物的活性產(chǎn)生抑制作用，并影響其群落結(jié)構(gòu)。如在考察乙醇對生物膜中微生物活性的影響時發(fā)現(xiàn)[55]，暴露在含有乙醇米糠水解液生物膜中活細胞的百分比為54.32%±7.10%，代謝活力僅為空白對照組(未暴露在毒害物質(zhì)中的生物膜)的40%。李鮮珠等[56]在研究苯酚菌降解特性時發(fā)現(xiàn)，隨著苯酚質(zhì)量濃度的增加(100 ～500 mg/L)，苯酚菌體內(nèi)的降解酶活性下降，導致試驗所用的混合菌株及單一菌株對苯酚的降解能力下降。此外，Admiraal等[57]的研究結(jié)果表明，光能自養(yǎng)細菌對Zn濃度的變化十分敏感，當Zn濃度達到1 000 μmol/L時，與光合作用有關(guān)的酶失活，導致光能自養(yǎng)細菌的活性幾乎完全被抑制。在探究生物膜反應(yīng)器對鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)的生物降解試驗時發(fā)現(xiàn)，BBP 首先被微生物降解生成DBP，接著轉(zhuǎn)化為DEP[58]。對生物膜中的微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，Achromatium的豐度達到25.5%，該菌對短鏈的PAEs如DBP、BBP具有較高的降解效率[59]，因此在降解過程中活性增強，成為生物膜中的優(yōu)勢菌屬。這一結(jié)論也證明了當生物膜暴露于毒害物質(zhì)中時，微生物群落活性及結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化，群落中敏感菌種將逐漸被具有耐受性的菌種取代[60]。另外，高濃度的毒害物質(zhì)可以使生物膜細菌瞬間失活，因此，在醫(yī)院消毒過程中，常使用清洗劑混加高濃度鄰苯二甲醛的方法強化清除醫(yī)療器械表面的生物膜[61]。

4 PAEs對EABs的可能影響機制

4.1 影響電活性微生物的定殖

電活性微生物在載體表面的定殖是EABs形成的關(guān)鍵步驟，主要受導電界面材料特性及電化學性能的影響。對生物電化學系統(tǒng)中的陽極群落研究發(fā)現(xiàn)，EABs中的傳統(tǒng)優(yōu)勢菌群為Geobacter及Shewanella物種等[37，62]，這些電活性微生物之所以能夠附著于電極表面生長、繁殖并保持高活性，是因為其對極化界面的電敏感性。電子的傳遞主要依賴細胞膜上的導電物質(zhì)，如納米導線和c型細胞色素蛋白，在完全氧化底物的過程中將電子定向傳遞到電極[63-65]。現(xiàn)有研究已表明，經(jīng)DBP處理后的細菌體細胞形狀不規(guī)則，細胞壁破碎，細胞質(zhì)不均勻并有空泡出現(xiàn)，細胞內(nèi)物質(zhì)量減少，核糖體不明顯甚至消失[51]。此外，Sarmin等[66]在探究微生物燃料電池強化去除鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)時發(fā)現(xiàn)，以DMP為底物驅(qū)動的微生物燃料電池產(chǎn)電量較低，這是由于DMP增大了電荷轉(zhuǎn)移阻力和傳質(zhì)阻力，使得電子穿梭體數(shù)量減少，導致電極表面的電活性微生物難以定殖，豐度降低。因此，當PAEs作用于EABs時，EABs中電活性微生物的蛋白質(zhì)合成場極易受到破壞，導致電活性微生物缺少用于電子傳遞的c型細胞色素蛋白以及催化生命活動所必要的酶，微生物在電極表面上的初步定殖會受到顯著影響。

4.2 影響EABs的演替

生物膜的演替表現(xiàn)在微生物多樣性的變化和優(yōu)勢種群的改變上。王龍春等[67]通過計算Simpson和Shannon多樣性指數(shù)后發(fā)現(xiàn) DMP 污染會降低微生物群落的多樣性，且隨著 DMP 濃度的增大，微生物群落中能夠利用DMP作為碳源的微生物類群將逐漸代替電活性微生物成為優(yōu)勢菌屬。這樣的演替過程很有可能導致電活性微生物的消失、生物膜的電子傳遞性能下降甚至失去電活性。除此之外，PAEs類物質(zhì)對具有黏性的菌膠團細菌和絲狀菌有抑制作用[68]，導致EABs演替過程中通過微菌落相互黏結(jié)作用來加厚生物膜的過程受到影響，最終阻礙EABs的正常演替。目前已發(fā)現(xiàn)的電活性微生物主要來自Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Aidobateria4個門，其中72%屬于Proteobacteria，16%屬于Firmicutes，3%屬于Bacteroidetes，8%屬于Aidobateria[69]，由此可見，屬于Proteobacteria門的電活性微生物是EABs的關(guān)鍵成分。Hung等[70]研究了DEHP對微生物群落的影響，發(fā)現(xiàn)DEHP濃度的升高顯著降低了微生物群落中Proteobacteria豐度，而能夠以DEHP為碳源進行代謝的Gemmatimonadetes豐度有所增加。此外，與普通生物膜相比，EABs表面會分布更多的電活性蛋白，提供了更多的吸附位點[71]，對PAEs的吸附作用會顯著強于普通生物膜。因此，PAEs會在EABs的演替過程中影響垂向分層的生物膜密度和電活性微生物豐度，從而使EABs的電活性逐漸改變。

4.3 影響EABs的功能

EABs主要具備生物催化產(chǎn)電和降解有機污染物兩種功能。研究證明EABs的氧化還原活性、電導率、厚度、活死細胞比率、緊密度及EPS電活性的改變將會不同程度地影響電化學系統(tǒng)的產(chǎn)電性能[72]。王沛芳等[73]考察了DBP對生物電化學系統(tǒng)產(chǎn)電性能的影響，發(fā)現(xiàn)當DBP質(zhì)量濃度從1 mg/L上升至10 mg/L時，系統(tǒng)的產(chǎn)電性能顯著下降，最大輸出電壓從0.36 V降至0.24 V，產(chǎn)電周期縮短了12 h，輸出功率減小了52.7%，內(nèi)阻增加了100%，說明高質(zhì)量濃度的DBP對生物電化學系統(tǒng)的電化學性能產(chǎn)生了不利影響。華萌[74]在研究MFC產(chǎn)電性能及其對PAEs類物質(zhì)去除效果的試驗中，以乙酸鈉和PAEs作為混合底物，驗證了EABs可以在去除有機污染物的同時穩(wěn)定輸出電能，但隨著PAEs所占比例的升高，MFC對應(yīng)的電流密度降低，電池內(nèi)阻逐漸增大，最大功率密度逐步減小，產(chǎn)電水平呈下降趨勢。此外，PAEs還會對EABs去除污染物的過程產(chǎn)生一定干擾，不利于生物電化學系統(tǒng)穩(wěn)定降解污染物。張婭[75]在研究不同PAEs進水濃度條件下三維電極生物膜的脫氮效果時發(fā)現(xiàn)，PAEs類物質(zhì)的加入導致系統(tǒng)總氮去除率產(chǎn)生明顯波動，波動范圍為75%～90%，說明在PAEs的沖擊下，生物膜中的反硝化菌受到PAEs的生物毒性作用，導致其豐度發(fā)生了變化，EABs功能發(fā)揮不穩(wěn)定，對系統(tǒng)的總氮穩(wěn)定脫除產(chǎn)生負面影響。

5 結(jié) 語

EABs在市政廢水能源化處理中具有廣闊的發(fā)展前景。PAEs等毒害物質(zhì)作為新型污染物廣泛存在于市政廢水中，并對工程化EABs的結(jié)構(gòu)形成和功能發(fā)揮產(chǎn)生顯著影響。建議未來在以下幾個方面進行重點研究：(a)探究PAEs對EABs電化學性能的影響機制，提出解決對策，降低PAEs對EABs降解污染物性能的影響；(b)利用電活性微生物的電流輸出特性，構(gòu)建新型的生物傳感器，實現(xiàn)對廢水中PAEs濃度的實時監(jiān)測；(c)以EABs為研究平臺，考察毒害物質(zhì)對微生物細胞之間物質(zhì)、能量、信息交流的影響機制，揭示毒害物質(zhì)干擾下的微生物群體效應(yīng)。