趵突泉濃香型白酒有機(jī)窖泥的培養(yǎng)研究

張夢(mèng)夢(mèng)，呂志遠(yuǎn)，蘇 寧，崔新瑩，王文潔

（濟(jì)南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司，山東濟(jì)南250115）

濃香型白酒在中國(guó)白酒消費(fèi)市場(chǎng)中占據(jù)著重要的地位，其主要生產(chǎn)工藝是“泥窖固態(tài)發(fā)酵，續(xù)糟配料，混蒸混燒”[1]。濃香型白酒與其他白酒的最主要區(qū)別在于使用的窖泥發(fā)酵方式的不同，窖泥是濃香型白酒生產(chǎn)最關(guān)鍵的物質(zhì)基礎(chǔ)，窖泥的質(zhì)量對(duì)于穩(wěn)定和提高白酒的質(zhì)量至關(guān)重要。目前，人工窖泥的制作按其培養(yǎng)物的不同，一般分為有機(jī)窖泥和無(wú)機(jī)窖泥兩種，一般每個(gè)地區(qū)都有自己特色的窖泥原料配方，且同一地區(qū)不同廠家的培養(yǎng)方法也是見(jiàn)仁見(jiàn)智[2]。

根據(jù)本廠試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與無(wú)機(jī)窖泥相比，有機(jī)窖泥更有利于窖池中有益微生物的生長(zhǎng)繁殖，使其處于一種良性循環(huán)中[3]。趵突泉公司根據(jù)多年的經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出了一套有機(jī)窖泥的培養(yǎng)方法。本研究在此基礎(chǔ)上，采用4種配方進(jìn)行有機(jī)窖泥培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為50 d。在這50 d中，每天對(duì)有機(jī)窖泥及外界氣溫進(jìn)行溫度檢測(cè)，并記錄下有機(jī)窖泥的感官指標(biāo)。每隔10 d對(duì)窖泥進(jìn)行取樣，測(cè)定窖泥各項(xiàng)理化指標(biāo)及微生物變化。最終通過(guò)對(duì)窖泥的感官鑒定、理化指標(biāo)及微生物變化的對(duì)比研究，判斷窖泥的老熟情況，得出最優(yōu)有機(jī)窖泥配方。應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，提高酒質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

耗材：黃土，泥炭，種子泥，黃水，酒尾，豆粕，大曲粉，己酸菌液，酒醅，新泥，酵母，二級(jí)酒，骨粉，蘋(píng)果，豬血，蠶蛹，白糖，黃豆粉，糯米。

表1 4種有機(jī)窖泥具體配方

儀器設(shè)備：發(fā)酵桶，溫度計(jì)。

1.2 質(zhì)量要求[4]

黃土：土質(zhì)細(xì)膩，含沙量低，黏性大，雜質(zhì)少，有利于保持營(yíng)養(yǎng)和水分，為窖泥微生物的生長(zhǎng)提供較好的棲息環(huán)境。

酒糟：濃香型發(fā)酵正常的新鮮酒醅。

黃水：選用pH5～6的黃水（煮沸）。

豆粕：選用東北產(chǎn)優(yōu)質(zhì)黃豆制成。

大曲粉：選自本廠優(yōu)質(zhì)中偏高溫大曲。

培泥用水：培泥用水加熱煮沸10 min，封口，冷卻至35℃左右使用。一方面，殺死水中微生物；另一方面，可以降低水的硬度[5]。

1.3 有機(jī)窖泥配方

有機(jī)窖泥具體配方，以1 m3黃土計(jì)算，見(jiàn)表1。

1.4 窖泥培養(yǎng)具體操作

1.4.1 原料除雜

將選好黃土進(jìn)行除雜處理，先過(guò)篩，去除土壤中的石塊或雜質(zhì)。

1.4.2 配料及攪拌

根據(jù)有機(jī)窖泥配方按比例依次加入所需固體材料（泥炭、種子泥、豆粕、大曲粉等），依次拌和均勻，再加入處理好的黃水、酒尾等液體原料。操作要點(diǎn)是邊添加邊拌和，使其混合均勻。成品窖泥水分控制在33%～45%，水分不足用準(zhǔn)備好的培泥用水補(bǔ)充。反復(fù)拌和至目測(cè)均勻，無(wú)干土，無(wú)成塊固體原料。和泥是關(guān)鍵，和泥不均會(huì)導(dǎo)致局部發(fā)酵，使窖泥長(zhǎng)期不能成熟[1]。

1.4.3 培菌發(fā)酵

培菌發(fā)酵階段是窖泥培養(yǎng)的關(guān)鍵，培泥要注意季節(jié)，趵突泉酒廠有機(jī)窖泥在七、八月份制作[6]。注意保持水溫，使和好的窖泥溫度為25～30℃，pH值范圍為5.5～7.2為宜，和好后，在30℃左右溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.4 發(fā)酵管理[7]

每天對(duì)培養(yǎng)窖泥進(jìn)行測(cè)溫，要加強(qiáng)窖泥發(fā)酵管理，切忌過(guò)冷過(guò)熱，使發(fā)酵溫度盡可能控制在35～40℃，培養(yǎng)50 d，即為成熟窖泥。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥培養(yǎng)過(guò)程中理化指標(biāo)變化情況

2.1.1 窖泥培養(yǎng)過(guò)程中水分、pH值含量變化

對(duì)窖泥培養(yǎng)過(guò)程中的4個(gè)配方窖泥水分、pH值的變化情況進(jìn)行分析，其結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 4個(gè)配方窖泥水分、pH值的變化趨勢(shì)圖

水分含量對(duì)窖泥的發(fā)酵至關(guān)重要。各種微生物的生化活動(dòng)都與窖泥含水量有著密切關(guān)系，水分過(guò)少時(shí)，微生物生長(zhǎng)、繁殖困難；水分過(guò)大時(shí)，窖泥過(guò)稀，搭窖困難，使用不便，人工窖泥必須濕潤(rùn)柔熟。且窖泥培養(yǎng)中不可忽視土壤的選擇，否則致使窖泥掛窖后投料不久窖池即出現(xiàn)不同程度的板結(jié)老化，各項(xiàng)指標(biāo)顯著下降。主要根源在于泥土雜質(zhì)多、沙性大，造成窖泥持水力差，窖泥因失水過(guò)快出現(xiàn)老化現(xiàn)象。泥炭的加入，可增加窖泥中水分的含量，起到一定程度的軟化作用。根據(jù)以前本廠有機(jī)窖泥的經(jīng)驗(yàn)，在各配方中加入20%的泥炭為宜。另外在拌和窖泥時(shí)杜絕加生水，以免帶入大量雜菌及增加硬度。

新培養(yǎng)的窖泥，水分含量在33%～45%之間為佳，而己酸菌的最適生長(zhǎng)水分≥35%。各配方均符合使用要求。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合實(shí)際窖泥培養(yǎng)方式，置于泥房培養(yǎng)。由于培泥在七八月份，溫度高，加之北方地區(qū)天氣干燥，水分蒸發(fā)量大，故而發(fā)酵結(jié)束（50 d）時(shí)水分含量相較于初始值略降。

窖泥pH值對(duì)微生物的生命活動(dòng)影響很大，不同的pH值可引起細(xì)胞膜電荷的變化，從而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還能影響代謝過(guò)程中酶的活性，改變生長(zhǎng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可給性以及有害物質(zhì)的毒性。己酸菌、丁酸菌都要求pH值在中性或略偏酸性條件下生長(zhǎng)繁殖，在實(shí)際生產(chǎn)中一般采用土壤的自然pH值進(jìn)行培養(yǎng)。

新培養(yǎng)的窖泥，pH值在5.5～7.2之間為佳，而己酸菌的最適生長(zhǎng)pH值是5.8～6.8。根據(jù)圖1分析得出，發(fā)酵30 d時(shí)，pH值降到最低，下降1.2～1.6。30 d之后，pH值逐漸升高，發(fā)酵結(jié)束時(shí)（50 d），窖泥pH值相較于初始值略微下降。故本次4個(gè)配方發(fā)酵成熟的窖泥的pH值，均符合使用要求。

2.1.2 窖泥培養(yǎng)過(guò)程中氨態(tài)氮、有效磷含量變化

窖泥培養(yǎng)過(guò)程中的4個(gè)配方窖泥氨態(tài)氮含量的變化情況，其結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 4個(gè)配方窖泥氨態(tài)氮、有效磷含量變化趨勢(shì)圖

氨態(tài)氮是窖泥功能菌生長(zhǎng)、繁殖所需的主要氮源。本次有機(jī)窖泥中的主要氮源主要來(lái)自黃豆粉等有機(jī)質(zhì)原料，避免使用無(wú)機(jī)原料，防止了由于以前無(wú)機(jī)窖泥配方中使用尿素、氯化銨等無(wú)機(jī)氮源，在微生物消耗完無(wú)機(jī)氮源后，其氯離子等離子濃度相對(duì)增大，導(dǎo)致窖泥中氫離子增多，使窖泥迅速酸化，導(dǎo)致窖泥板結(jié)、老化。

(2)報(bào)名結(jié)束，整理所有參賽者的信息，召集參賽者開(kāi)賽前會(huì)議，介紹比賽的具體內(nèi)容以及流程，解答參賽者的疑問(wèn)，發(fā)布第一環(huán)節(jié)的比賽試題；

根據(jù)以前本廠檢修期數(shù)據(jù)，新窖泥氨態(tài)氮含量的范圍為40～180 mg/100 g干土。根據(jù)圖2分析得出，發(fā)酵30 d時(shí)，氨態(tài)氮含量驟降，說(shuō)明在窖泥發(fā)酵過(guò)程中，氨態(tài)氮（氮源）被大量消耗，可能是因?yàn)槲⑸锎罅可L(zhǎng)繁殖消耗所致。后期氨態(tài)氮有緩慢升高的趨勢(shì)，可能是因?yàn)槲⑸锎x導(dǎo)致的。

磷是增強(qiáng)細(xì)菌代謝的重要元素，細(xì)菌生長(zhǎng)主要靠細(xì)胞增生。新細(xì)胞的形成必須有核蛋白，而磷是核蛋白的重要物質(zhì)成分。由于磷在其中起著重要作用，因此，磷是己酸菌大量增殖的必需物質(zhì)。同時(shí)，磷又是參與乙醇、乙酸合成己酸這一發(fā)酵過(guò)程的重要物質(zhì)。所以，有效磷含量的多少是衡量窖泥質(zhì)量?jī)?yōu)劣的一項(xiàng)重要指標(biāo)。有機(jī)窖泥拒絕使用無(wú)機(jī)磷鹽，主要的原因是無(wú)機(jī)磷酸中含有較多的有害重金屬，這些重金屬加入到窖泥中不會(huì)被微生物分解，并在窖泥中不斷積累，對(duì)微生物產(chǎn)生毒害作用。

根據(jù)以前本廠檢修期數(shù)據(jù)，新窖泥有效磷含量的范圍為80～170 mg/100 g干土。根據(jù)圖2分析得出，配方1、配方2的磷含量較配方3高，這是由于配方中加入骨粉及豬血的比例較高的原因。有效磷含量符合優(yōu)質(zhì)人工窖泥有效磷含量要求。

2.1.3 窖泥培養(yǎng)過(guò)程中有效鉀、腐殖質(zhì)含量變化

圖3 4個(gè)配方窖泥有效鉀、腐殖質(zhì)含量變化趨勢(shì)圖

根據(jù)以前本廠檢修期數(shù)據(jù)，新窖泥有效鉀含量的范圍為0.1%～0.5%。根據(jù)圖3分析得出，有效鉀含量波動(dòng)趨勢(shì)并不明顯。

窖泥中的腐殖質(zhì)是在微生物酶的作用下形成的小分子化合物和微生物代謝產(chǎn)物的合成物，部分是由其他有機(jī)物腐殖化的過(guò)程形成。腐殖質(zhì)是一類特殊分子有機(jī)化合物，分子量大，功能團(tuán)多，解離后帶電量大，能夠?yàn)榻涯辔⑸锾峁┮粋€(gè)良好的生長(zhǎng)環(huán)境，為微生物提供營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)窖泥營(yíng)養(yǎng)的保持和酸度的調(diào)節(jié)有重要作用，還具有良好的保水作用。腐殖質(zhì)及其分解產(chǎn)物是微生物主要養(yǎng)分，從其含量高低可以判斷窖泥和土壤的優(yōu)劣。腐殖質(zhì)的含量與泥炭的加入量直接相關(guān)，經(jīng)本廠以前實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，20%的泥炭加入量已足夠達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。根據(jù)以前本廠檢修期數(shù)據(jù)，新培養(yǎng)的窖泥腐殖質(zhì)在7%～12%之間為佳。根據(jù)圖3分析得出，腐殖質(zhì)在窖泥培養(yǎng)期間，含量較初始值微微下降，但并沒(méi)有表現(xiàn)出比較明顯的變化趨勢(shì)。

2.2 窖泥培養(yǎng)過(guò)程中微生物變化情況

現(xiàn)階段對(duì)窖泥的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究大多是通過(guò)窖泥的顏色、手感、氣味等這些感官指標(biāo)對(duì)窖泥進(jìn)行判定，或者通過(guò)窖泥的理化指標(biāo)和平板計(jì)數(shù)分析窖泥的差異和變化規(guī)律，對(duì)于窖泥中的非培養(yǎng)微生物知之甚少。因此公司在實(shí)際生產(chǎn)中利用PCR-DGGE技術(shù)分析不同類型和質(zhì)量等級(jí)窖泥的微生物組成差異，鑒定優(yōu)勢(shì)微生物的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)信息，找到代表某一類型的特征指紋圖譜，并結(jié)合感官評(píng)價(jià)和理化分析指標(biāo)，為窖泥質(zhì)量作出更加全面的評(píng)價(jià)提供合理的數(shù)據(jù)支持。

提取這幾種配方不同發(fā)酵時(shí)間的窖泥的DNA，利用細(xì)菌引物F338/R518擴(kuò)增16S RNA的V3區(qū)，擴(kuò)增得到200～300 bp的條帶（如圖4所示），與目的基因相符。

圖4 窖泥樣品細(xì)菌基因片段擴(kuò)增電泳圖

將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳，結(jié)果如圖5所示，切取圖中清晰明亮的條帶，經(jīng)PCR擴(kuò)增、連接T1載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后送交生工測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中經(jīng)BLAST結(jié)果見(jiàn)表2。

結(jié)合圖5和表2可知，4種方案配置出的窖泥在群落結(jié)構(gòu)上有一定的相似性，均是以乳酸菌屬（Lactobacillus）、魏氏菌屬（Weissella）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）為主。在發(fā)酵到20 d時(shí)，窖泥的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，以乳酸菌屬（Lactobacillus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、Chryseobacterium、Empedobacter、棒桿菌屬（Corynebacterium）、亮桿菌屬（Leucobacter）為優(yōu)勢(shì)菌，此時(shí)這4種窖泥配方在細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)上一致。到發(fā)酵50 d時(shí)，整體群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，細(xì)菌的多樣性進(jìn)一步增加，此時(shí)這4種窖泥配方的群落結(jié)構(gòu)整體一致，其中配方三（泳道11）產(chǎn)生了區(qū)別于其他配方的優(yōu)勢(shì)菌巨球型菌屬（Megasphaera）和紫單胞菌科細(xì)菌，配方四（泳道12）產(chǎn)生了區(qū)別于其他配方的優(yōu)勢(shì)菌醋桿菌屬（Acetobacter）細(xì)菌。從整體上看，這4種培養(yǎng)方式的有機(jī)窖泥在發(fā)酵初始、中間和結(jié)束時(shí)含有的微生物種類差異較小。

圖5 窖泥樣品細(xì)菌DGGE指紋圖譜

表2 DGGE條帶序列NCBI BLAST結(jié)果

2.3 窖泥培養(yǎng)過(guò)程中感官變化情況

成熟窖泥的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)中感官評(píng)價(jià)尤為重要。窖泥培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)專家鑒定其質(zhì)量。培養(yǎng)發(fā)酵50 d后不同配方人工窖泥感官鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3表明，從顏色、氣味和手感幾個(gè)方面來(lái)看，各方案窖泥經(jīng)培養(yǎng)后都有一定的變化，其中配方4在感官上要明顯優(yōu)于配方1、配方2、配方3。配方4具有舒適的酯香和老窖泥氣味。因此，認(rèn)為配方4培養(yǎng)出的窖泥老熟程度最好，更適合釀酒生產(chǎn)。

根據(jù)各方案理化數(shù)據(jù)顯示，4個(gè)配方的理化指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)，說(shuō)明本公司窖泥配方設(shè)計(jì)比較合理，這也有賴于本公司前期多年的研究經(jīng)驗(yàn)。而配方4培養(yǎng)的窖泥更有利于釀酒微生物的生長(zhǎng)繁殖。綜上，我們選用配方4作為本廠有機(jī)窖泥最佳方案。

表3 不同配方人工窖泥的感官鑒定

3 小結(jié)

培養(yǎng)窖泥的實(shí)質(zhì)，一是培養(yǎng)窖泥中的優(yōu)質(zhì)有益菌類，二是為己酸菌等微生物創(chuàng)造一個(gè)良好的生長(zhǎng)環(huán)境，使之能持續(xù)有效的生長(zhǎng)，而不是提供窖泥作增香來(lái)源。

要培養(yǎng)出優(yōu)質(zhì)的有機(jī)窖泥，一定要有科學(xué)合理的窖泥配方，同時(shí)原料質(zhì)量也很重要。不要根據(jù)窖泥厭氧微生物的營(yíng)養(yǎng)需求，盲目添加水果、谷糧原料等，而忽視添加黃水、尾酒等。不宜在黃泥中加入大量污泥。因?yàn)閬?lái)自污泥的微生物大多是與釀酒無(wú)關(guān)的細(xì)菌，這樣培養(yǎng)的窖泥會(huì)帶來(lái)異雜味，影響出酒質(zhì)量[7-8]。