趵突泉濃香型白酒有機窖泥的培養(yǎng)研究

張夢夢，呂志遠，蘇 寧，崔新瑩，王文潔

（濟南趵突泉釀酒有限責任公司，山東濟南250115）

濃香型白酒在中國白酒消費市場中占據(jù)著重要的地位，其主要生產(chǎn)工藝是“泥窖固態(tài)發(fā)酵，續(xù)糟配料，混蒸混燒”[1]。濃香型白酒與其他白酒的最主要區(qū)別在于使用的窖泥發(fā)酵方式的不同，窖泥是濃香型白酒生產(chǎn)最關鍵的物質基礎，窖泥的質量對于穩(wěn)定和提高白酒的質量至關重要。目前，人工窖泥的制作按其培養(yǎng)物的不同，一般分為有機窖泥和無機窖泥兩種，一般每個地區(qū)都有自己特色的窖泥原料配方，且同一地區(qū)不同廠家的培養(yǎng)方法也是見仁見智[2]。

根據(jù)本廠試驗發(fā)現(xiàn)，與無機窖泥相比，有機窖泥更有利于窖池中有益微生物的生長繁殖，使其處于一種良性循環(huán)中[3]。趵突泉公司根據(jù)多年的經(jīng)驗，總結出了一套有機窖泥的培養(yǎng)方法。本研究在此基礎上，采用4種配方進行有機窖泥培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為50 d。在這50 d中，每天對有機窖泥及外界氣溫進行溫度檢測，并記錄下有機窖泥的感官指標。每隔10 d對窖泥進行取樣，測定窖泥各項理化指標及微生物變化。最終通過對窖泥的感官鑒定、理化指標及微生物變化的對比研究，判斷窖泥的老熟情況，得出最優(yōu)有機窖泥配方。應用于生產(chǎn)實踐，提高酒質。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

耗材：黃土，泥炭，種子泥，黃水，酒尾，豆粕，大曲粉，己酸菌液，酒醅，新泥，酵母，二級酒，骨粉，蘋果，豬血，蠶蛹，白糖，黃豆粉，糯米。

表1 4種有機窖泥具體配方

儀器設備：發(fā)酵桶，溫度計。

1.2 質量要求[4]

黃土：土質細膩，含沙量低，黏性大，雜質少，有利于保持營養(yǎng)和水分，為窖泥微生物的生長提供較好的棲息環(huán)境。

酒糟：濃香型發(fā)酵正常的新鮮酒醅。

黃水：選用pH5～6的黃水（煮沸）。

豆粕：選用東北產(chǎn)優(yōu)質黃豆制成。

大曲粉：選自本廠優(yōu)質中偏高溫大曲。

培泥用水：培泥用水加熱煮沸10 min，封口，冷卻至35℃左右使用。一方面，殺死水中微生物；另一方面，可以降低水的硬度[5]。

1.3 有機窖泥配方

有機窖泥具體配方，以1 m3黃土計算，見表1。

1.4 窖泥培養(yǎng)具體操作

1.4.1 原料除雜

將選好黃土進行除雜處理，先過篩，去除土壤中的石塊或雜質。

1.4.2 配料及攪拌

根據(jù)有機窖泥配方按比例依次加入所需固體材料（泥炭、種子泥、豆粕、大曲粉等），依次拌和均勻，再加入處理好的黃水、酒尾等液體原料。操作要點是邊添加邊拌和，使其混合均勻。成品窖泥水分控制在33%～45%，水分不足用準備好的培泥用水補充。反復拌和至目測均勻，無干土，無成塊固體原料。和泥是關鍵，和泥不均會導致局部發(fā)酵，使窖泥長期不能成熟[1]。

1.4.3 培菌發(fā)酵

培菌發(fā)酵階段是窖泥培養(yǎng)的關鍵，培泥要注意季節(jié)，趵突泉酒廠有機窖泥在七、八月份制作[6]。注意保持水溫，使和好的窖泥溫度為25～30℃，pH值范圍為5.5～7.2為宜，和好后，在30℃左右溫度下進行培養(yǎng)。

1.4.4 發(fā)酵管理[7]

每天對培養(yǎng)窖泥進行測溫，要加強窖泥發(fā)酵管理，切忌過冷過熱，使發(fā)酵溫度盡可能控制在35～40℃，培養(yǎng)50 d，即為成熟窖泥。

2 結果與分析

2.1 窖泥培養(yǎng)過程中理化指標變化情況

2.1.1 窖泥培養(yǎng)過程中水分、pH值含量變化

對窖泥培養(yǎng)過程中的4個配方窖泥水分、pH值的變化情況進行分析，其結果見圖1。

圖1 4個配方窖泥水分、pH值的變化趨勢圖

水分含量對窖泥的發(fā)酵至關重要。各種微生物的生化活動都與窖泥含水量有著密切關系，水分過少時，微生物生長、繁殖困難；水分過大時，窖泥過稀，搭窖困難，使用不便，人工窖泥必須濕潤柔熟。且窖泥培養(yǎng)中不可忽視土壤的選擇，否則致使窖泥掛窖后投料不久窖池即出現(xiàn)不同程度的板結老化，各項指標顯著下降。主要根源在于泥土雜質多、沙性大，造成窖泥持水力差，窖泥因失水過快出現(xiàn)老化現(xiàn)象。泥炭的加入，可增加窖泥中水分的含量，起到一定程度的軟化作用。根據(jù)以前本廠有機窖泥的經(jīng)驗，在各配方中加入20%的泥炭為宜。另外在拌和窖泥時杜絕加生水，以免帶入大量雜菌及增加硬度。

新培養(yǎng)的窖泥，水分含量在33%～45%之間為佳，而己酸菌的最適生長水分≥35%。各配方均符合使用要求。本實驗結合實際窖泥培養(yǎng)方式，置于泥房培養(yǎng)。由于培泥在七八月份，溫度高，加之北方地區(qū)天氣干燥，水分蒸發(fā)量大，故而發(fā)酵結束（50 d）時水分含量相較于初始值略降。

窖泥pH值對微生物的生命活動影響很大，不同的pH值可引起細胞膜電荷的變化，從而影響微生物對營養(yǎng)物質的吸收，還能影響代謝過程中酶的活性，改變生長環(huán)境中營養(yǎng)物質的可給性以及有害物質的毒性。己酸菌、丁酸菌都要求pH值在中性或略偏酸性條件下生長繁殖，在實際生產(chǎn)中一般采用土壤的自然pH值進行培養(yǎng)。

新培養(yǎng)的窖泥，pH值在5.5～7.2之間為佳，而己酸菌的最適生長pH值是5.8～6.8。根據(jù)圖1分析得出，發(fā)酵30 d時，pH值降到最低，下降1.2～1.6。30 d之后，pH值逐漸升高，發(fā)酵結束時（50 d），窖泥pH值相較于初始值略微下降。故本次4個配方發(fā)酵成熟的窖泥的pH值，均符合使用要求。

2.1.2 窖泥培養(yǎng)過程中氨態(tài)氮、有效磷含量變化

窖泥培養(yǎng)過程中的4個配方窖泥氨態(tài)氮含量的變化情況，其結果見圖2。

圖2 4個配方窖泥氨態(tài)氮、有效磷含量變化趨勢圖

氨態(tài)氮是窖泥功能菌生長、繁殖所需的主要氮源。本次有機窖泥中的主要氮源主要來自黃豆粉等有機質原料，避免使用無機原料，防止了由于以前無機窖泥配方中使用尿素、氯化銨等無機氮源，在微生物消耗完無機氮源后，其氯離子等離子濃度相對增大，導致窖泥中氫離子增多，使窖泥迅速酸化，導致窖泥板結、老化。

(2)報名結束，整理所有參賽者的信息，召集參賽者開賽前會議，介紹比賽的具體內容以及流程，解答參賽者的疑問，發(fā)布第一環(huán)節(jié)的比賽試題；

根據(jù)以前本廠檢修期數(shù)據(jù)，新窖泥氨態(tài)氮含量的范圍為40～180 mg/100 g干土。根據(jù)圖2分析得出，發(fā)酵30 d時，氨態(tài)氮含量驟降，說明在窖泥發(fā)酵過程中，氨態(tài)氮（氮源）被大量消耗，可能是因為微生物大量生長繁殖消耗所致。后期氨態(tài)氮有緩慢升高的趨勢，可能是因為微生物代謝導致的。

磷是增強細菌代謝的重要元素，細菌生長主要靠細胞增生。新細胞的形成必須有核蛋白，而磷是核蛋白的重要物質成分。由于磷在其中起著重要作用，因此，磷是己酸菌大量增殖的必需物質。同時，磷又是參與乙醇、乙酸合成己酸這一發(fā)酵過程的重要物質。所以，有效磷含量的多少是衡量窖泥質量優(yōu)劣的一項重要指標。有機窖泥拒絕使用無機磷鹽，主要的原因是無機磷酸中含有較多的有害重金屬，這些重金屬加入到窖泥中不會被微生物分解，并在窖泥中不斷積累，對微生物產(chǎn)生毒害作用。

根據(jù)以前本廠檢修期數(shù)據(jù)，新窖泥有效磷含量的范圍為80～170 mg/100 g干土。根據(jù)圖2分析得出，配方1、配方2的磷含量較配方3高，這是由于配方中加入骨粉及豬血的比例較高的原因。有效磷含量符合優(yōu)質人工窖泥有效磷含量要求。

2.1.3 窖泥培養(yǎng)過程中有效鉀、腐殖質含量變化

圖3 4個配方窖泥有效鉀、腐殖質含量變化趨勢圖

根據(jù)以前本廠檢修期數(shù)據(jù)，新窖泥有效鉀含量的范圍為0.1%～0.5%。根據(jù)圖3分析得出，有效鉀含量波動趨勢并不明顯。

窖泥中的腐殖質是在微生物酶的作用下形成的小分子化合物和微生物代謝產(chǎn)物的合成物，部分是由其他有機物腐殖化的過程形成。腐殖質是一類特殊分子有機化合物，分子量大，功能團多，解離后帶電量大，能夠為窖泥微生物提供一個良好的生長環(huán)境，為微生物提供營養(yǎng)元素，對窖泥營養(yǎng)的保持和酸度的調節(jié)有重要作用，還具有良好的保水作用。腐殖質及其分解產(chǎn)物是微生物主要養(yǎng)分，從其含量高低可以判斷窖泥和土壤的優(yōu)劣。腐殖質的含量與泥炭的加入量直接相關，經(jīng)本廠以前實驗發(fā)現(xiàn)，20%的泥炭加入量已足夠達到標準要求。根據(jù)以前本廠檢修期數(shù)據(jù)，新培養(yǎng)的窖泥腐殖質在7%～12%之間為佳。根據(jù)圖3分析得出，腐殖質在窖泥培養(yǎng)期間，含量較初始值微微下降，但并沒有表現(xiàn)出比較明顯的變化趨勢。

2.2 窖泥培養(yǎng)過程中微生物變化情況

現(xiàn)階段對窖泥的質量評價研究大多是通過窖泥的顏色、手感、氣味等這些感官指標對窖泥進行判定，或者通過窖泥的理化指標和平板計數(shù)分析窖泥的差異和變化規(guī)律，對于窖泥中的非培養(yǎng)微生物知之甚少。因此公司在實際生產(chǎn)中利用PCR-DGGE技術分析不同類型和質量等級窖泥的微生物組成差異，鑒定優(yōu)勢微生物的系統(tǒng)發(fā)育學信息，找到代表某一類型的特征指紋圖譜，并結合感官評價和理化分析指標，為窖泥質量作出更加全面的評價提供合理的數(shù)據(jù)支持。

提取這幾種配方不同發(fā)酵時間的窖泥的DNA，利用細菌引物F338/R518擴增16S RNA的V3區(qū)，擴增得到200～300 bp的條帶（如圖4所示），與目的基因相符。

圖4 窖泥樣品細菌基因片段擴增電泳圖

將上述PCR擴增產(chǎn)物進行DGGE電泳，結果如圖5所示，切取圖中清晰明亮的條帶，經(jīng)PCR擴增、連接T1載體，轉化至感受態(tài)細胞，擴大培養(yǎng)后送交生工測序公司進行測序。測序結果在NCBI網(wǎng)站中經(jīng)BLAST結果見表2。

結合圖5和表2可知，4種方案配置出的窖泥在群落結構上有一定的相似性，均是以乳酸菌屬（Lactobacillus）、魏氏菌屬（Weissella）和不動桿菌屬（Acinetobacter）為主。在發(fā)酵到20 d時，窖泥的群落結構發(fā)生改變，以乳酸菌屬（Lactobacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、Chryseobacterium、Empedobacter、棒桿菌屬（Corynebacterium）、亮桿菌屬（Leucobacter）為優(yōu)勢菌，此時這4種窖泥配方在細菌的群落結構上一致。到發(fā)酵50 d時，整體群落結構發(fā)生了改變，細菌的多樣性進一步增加，此時這4種窖泥配方的群落結構整體一致，其中配方三（泳道11）產(chǎn)生了區(qū)別于其他配方的優(yōu)勢菌巨球型菌屬（Megasphaera）和紫單胞菌科細菌，配方四（泳道12）產(chǎn)生了區(qū)別于其他配方的優(yōu)勢菌醋桿菌屬（Acetobacter）細菌。從整體上看，這4種培養(yǎng)方式的有機窖泥在發(fā)酵初始、中間和結束時含有的微生物種類差異較小。

圖5 窖泥樣品細菌DGGE指紋圖譜

表2 DGGE條帶序列NCBI BLAST結果

2.3 窖泥培養(yǎng)過程中感官變化情況

成熟窖泥的評判標準中感官評價尤為重要。窖泥培養(yǎng)結束后，經(jīng)專家鑒定其質量。培養(yǎng)發(fā)酵50 d后不同配方人工窖泥感官鑒定結果見表3。

表3表明，從顏色、氣味和手感幾個方面來看，各方案窖泥經(jīng)培養(yǎng)后都有一定的變化，其中配方4在感官上要明顯優(yōu)于配方1、配方2、配方3。配方4具有舒適的酯香和老窖泥氣味。因此，認為配方4培養(yǎng)出的窖泥老熟程度最好，更適合釀酒生產(chǎn)。

根據(jù)各方案理化數(shù)據(jù)顯示，4個配方的理化指標均在正常范圍之內，說明本公司窖泥配方設計比較合理，這也有賴于本公司前期多年的研究經(jīng)驗。而配方4培養(yǎng)的窖泥更有利于釀酒微生物的生長繁殖。綜上，我們選用配方4作為本廠有機窖泥最佳方案。

表3 不同配方人工窖泥的感官鑒定

3 小結

培養(yǎng)窖泥的實質，一是培養(yǎng)窖泥中的優(yōu)質有益菌類，二是為己酸菌等微生物創(chuàng)造一個良好的生長環(huán)境，使之能持續(xù)有效的生長，而不是提供窖泥作增香來源。

要培養(yǎng)出優(yōu)質的有機窖泥，一定要有科學合理的窖泥配方，同時原料質量也很重要。不要根據(jù)窖泥厭氧微生物的營養(yǎng)需求，盲目添加水果、谷糧原料等，而忽視添加黃水、尾酒等。不宜在黃泥中加入大量污泥。因為來自污泥的微生物大多是與釀酒無關的細菌，這樣培養(yǎng)的窖泥會帶來異雜味，影響出酒質量[7-8]。