利用GC×GC-TOFMS鑒定包包曲中的游離香氣成分

鄭 佳，趙 東，何張?zhí)m，張建敏，劉志鵬，楊康卓，喬宗偉

（宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644000）

我國(guó)大曲根據(jù)制曲過程中頂溫的高低，可劃分為中溫大曲、中高溫大曲和高溫大曲，而正是由于品溫的高低差異以及曲房?jī)?nèi)溫濕度的影響，引起不同類型大曲培曲過程中微生物菌群的差異顯著，進(jìn)而造就了不同類型大曲的酶活力和香氣特征差異顯著[1]。大曲不僅為白酒發(fā)酵提供微生物類和酶類，還為白酒發(fā)酵提供豐富的曲香類成分，但是，迄今對(duì)白酒曲香的成因以及特征組分的研究還十分欠缺。

多種前處理方法應(yīng)用于大曲風(fēng)味的研究，如頂空固相微萃取、溶劑萃取等[2-6]。近來，我們利用多種萃取方法結(jié)合GC-MS研究了五糧液包包曲中的風(fēng)味成分[7]。假設(shè)發(fā)酵過程中大曲自身風(fēng)味成分沒有發(fā)生代謝變化，在糟醅發(fā)酵結(jié)束后的蒸餾過程中，大曲的風(fēng)味成分必將隨著蒸汽進(jìn)入基酒，進(jìn)而影響白酒酒體風(fēng)味特征。但是，對(duì)大曲自身游離態(tài)的香氣成分的構(gòu)成，尤其是隨蒸餾進(jìn)入蒸餾液中游離風(fēng)味成分的認(rèn)識(shí)還需要大量研究。

因此，本研究的目的就是利用全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜研究包包曲中自身游離態(tài)的香氣成分，對(duì)科學(xué)認(rèn)識(shí)包包曲對(duì)白酒酒體風(fēng)味中曲香的貢獻(xiàn)度具有極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：生產(chǎn)用包包曲粉，采自宜賓五糧液股份有限公司釀酒車間。

試劑及耗材：二氯甲烷和甲醇均為HPLC級(jí)，購(gòu)自百靈威公司；正戊烷，分析純，成都科龍化工廠；無水硫酸鈉，ACS級(jí)，購(gòu)自阿拉丁公司；固相萃取柱（SPE柱，填料為L(zhǎng)iChrolut EN，0.2 g/3mL），購(gòu)自德國(guó)Merck公司。

儀器設(shè)備：全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（GC×GC-TOFMS）由Agilent 7890B氣相色譜（Agilent Technologist，美國(guó)）、Pegasus 4D飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（LECO，美國(guó)）和多功能自動(dòng)進(jìn)樣器（Gerstel，ML2，德國(guó)）組成；調(diào)制器（LECO，美國(guó)）為液氮型調(diào)制器；全二維氣相色譜由一維氣相色譜柱箱和安裝在其內(nèi)的獨(dú)立控溫的二維色譜柱箱構(gòu)成。一維色譜柱為極性柱DB-WAXext（30 m×0.25 mm×0.25 μm，J&W，美國(guó)），二維色譜柱為中等極性柱Rxi-17Sil MS（1.6 m×0.1 mm×0.1 μm，Restek，美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 包包曲清蒸

稱取1 kg樣品于自制不銹鋼小甑桶中（甑容為10 L），底鍋中加入2 L蒸餾水，打開電爐蒸餾20 min，收集所有蒸餾液。

1.2.2 香氣成分提取

吸取20 mL樣品蒸餾液，上樣于預(yù)先分別經(jīng)過5 mL二氯甲烷、甲醇和蒸餾水平衡的SPE柱，保持3～5 mL/min流速，上樣結(jié)束后，用5 mL蒸餾水洗滌填料，真空下干燥，再加入3 mL二氯甲烷洗脫，溫和N2吹掃濃縮至0.25 mL。

1.2.3 GC×GC-TOFMS條件

GC條件：進(jìn)樣口溫度230℃，一維柱箱起始溫度45℃，保持3 min，再以5℃/min升溫至230℃并保持10 min。GC二維柱箱全程保持比一維柱箱高5℃。調(diào)制補(bǔ)償溫度20℃。調(diào)制周期為4 s（熱脈沖時(shí)間0.8 s）。色譜柱采用恒流模式，載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），流速為1 mL/min。進(jìn)樣口為不分流進(jìn)樣方式，進(jìn)樣量為1 μL。

TOFMS條件：GC連接線溫度240℃，電離電壓-70 eV，離子源溫度230℃，檢測(cè)器電壓1430 V，質(zhì)量數(shù)范圍35～400 amu，數(shù)據(jù)采集頻率100 spectra/s。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

參考文獻(xiàn)所述方法[8]，采用ChromaTOF軟件進(jìn)行自動(dòng)解卷積和譜庫(kù)（mainlib,standards,NIST和replib）比對(duì)，并結(jié)合香氣成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間、待測(cè)物質(zhì)的保留指數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道值等進(jìn)行物質(zhì)的綜合鑒定。選擇相似度大于800、信噪比大于50的組分作為主要分析對(duì)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 二維總離子流圖

假設(shè)包包曲中的風(fēng)味物質(zhì)在窖池發(fā)酵過程中并未發(fā)生變化，由此，在完成發(fā)酵之后，糟醅蒸餾過程中之前加入的包包曲中風(fēng)味物質(zhì)勢(shì)必會(huì)隨蒸汽而蒸餾出，并在白酒酒體中富集。在此種條件下，采用清蒸包包曲的方式獲取包包曲在模擬蒸餾條件下?lián)]發(fā)性風(fēng)味成分，并利用SPE萃取濃縮得到包包曲的風(fēng)味物質(zhì)，最后利用GC×GC強(qiáng)大的色譜分離能力以及TOFMS高速掃描速度和自動(dòng)解卷積能力，獲得了包包曲的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)二維總離子流圖（圖1）。由圖1可知，絕大部分的風(fēng)味物質(zhì)在調(diào)制時(shí)間3 s以內(nèi)出峰，全二維色譜圖清晰的顯示出了包包曲中的風(fēng)味物質(zhì)。圖1(B)中主要的物質(zhì)包括戊醛、己醛、2-戊醇、正丁醇、2-庚酮、正戊醇和己酸乙酯；圖1(C)中主要的物質(zhì)是吡嗪類物質(zhì)，包括2,3-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪等；圖1(D)中主要的物質(zhì)包括芳香族和內(nèi)酯類，如苯乙醛、苯乙醇、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等。

圖1 包包曲清蒸液中香氣成分的二維總離子流圖

2.2 主要香氣成分

采用Pegasus 4D飛行時(shí)間質(zhì)譜儀自帶工作站軟件ChromaTOF對(duì)NIST質(zhì)譜庫(kù)的檢索結(jié)合單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜和保留時(shí)間、文獻(xiàn)保留指數(shù)等綜合對(duì)比，共定性得到209個(gè)化合物，其中以醇類、芳香族、醛類、吡嗪、酮類為主，分別檢出了34個(gè)、30個(gè)、22個(gè)、21個(gè)和26個(gè)。

圖2 包包曲中各類型化合物數(shù)量

2.3 典型的風(fēng)味成分

2.3.1 吡嗪類

吡嗪類物質(zhì)是白酒中主要的含氮化合物。這類物質(zhì)主要呈現(xiàn)巧克力、堅(jiān)果、花生味等香氣，被認(rèn)為是大曲中焦香味、烘焙味的主要來源[4]。由于其閾值較低，因此對(duì)白酒香氣具有特殊的貢獻(xiàn)，但由于其含量較低，為其鑒定及定量造成了一定困難。本研究結(jié)合了SPE的選擇吸附能力以及GC×GCTOFMS的全掃描功能，提供了一種可靠的方法，可準(zhǔn)確鑒定白酒或包包曲中的吡嗪類物質(zhì)。

表1 包包曲中的游離吡嗪類化合物

本研究中共檢出21種吡嗪類物質(zhì)，如表1所示。首次在包包曲中檢測(cè)到的吡嗪類物質(zhì)有吡嗪、2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪、2-乙?；拎?、2,5-二甲基-3-(3-甲基丁基)-吡嗪、4-甲基吡咯并[1,2-a]吡嗪。以面積歸一法定量分析可知，2-甲基吡嗪含量最高（相對(duì)峰面積比為3%），其次為2,6-二甲基吡嗪（3%）、三甲基吡嗪（2%）、2,3-二甲基吡嗪（1%）、2,5-二甲基吡嗪（1%）、四甲基吡嗪（1%）。

吡嗪類化合物主要由大曲發(fā)酵過程中氨基酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生或有酶參與的褐變反應(yīng)產(chǎn)生，除此之外，也可以由微生物在曲藥中迅速繁殖并代謝產(chǎn)生[9-10]。研究表明[11]，在包包曲的生產(chǎn)過程中，吡嗪類物質(zhì)隨著發(fā)酵時(shí)間增加而增加，并且降溫階段是吡嗪類物質(zhì)產(chǎn)生的主要時(shí)期。

2.3.2 芳香族

本研究中共檢出30種芳香類物質(zhì)（表2），包括芳香酮類8種，芳香醛類6種，酚類5種，芳香醇類4種，芳香酯類2種，萘2種，吡啶1種，吲哚1種。其中首次在包包曲中檢測(cè)到的物質(zhì)有1-苯基-2-丙酮、3-甲基苯乙酮、4-甲基苯乙酮、2-苯基丙烯醛、2-苯基-1-丙醇、α-亞乙基-苯乙醛、3,4-二甲基苯乙酮、DL-β-乙基苯乙基乙醇、2-甲基苯酚、4-甲氧基苯甲醛、5-甲基-2-苯基-2-己醛、1-四甲基萘酮、己酸苯乙酯、3-氨基苯乙酮、3-苯基吡啶、二苯甲酮、3-甲基吲哚。采用峰面積歸一法定量，包包曲中含量最高的芳香類物質(zhì)為苯乙醇（10%），其次為苯乙醛（10%）、苯甲醛（2%）、苯乙酮（2%）以及苯酚（1%）。

表2 包包曲中的游離芳香族化合物

芳香類物質(zhì)是賦予大曲豐富且復(fù)雜氣味的一類化合物，主要貢獻(xiàn)花香、甜香等香氣。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，苯乙醛在濃香型大曲中的香氣稀釋因子（FD=243），具有重要的香氣貢獻(xiàn)。

酚類物質(zhì)是一類具有特殊香氣的芳香類化合物，如苯酚呈現(xiàn)一種類似墨水、西藥的刺激性氣味，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚貢獻(xiàn)典型的煙熏味，對(duì)甲酚貢獻(xiàn)類似馬廄味，愈創(chuàng)木酚在低濃度時(shí)呈現(xiàn)水果香、甜香的香氣，2-甲基苯酚呈現(xiàn)西藥、墨水的氣味。前四者在46%vol乙醇水溶液中的嗅覺閾值分別為：18.91 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、13.41 mg/L；2-甲基苯酚在水中的閾值為0.25 mg/L[13]。有研究表明[14]，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚是賦予醬油特殊醬香味的揮發(fā)性風(fēng)味成分，其來源可能是制曲溫度超過60℃時(shí)，原料中的阿魏酸逐步釋放后在微生物作用下形成的。

2.3.3 醛類

如表3所示，共鑒定出醛類物質(zhì)22種，包括不飽和醛14種、直鏈飽和醛6種以及支鏈飽和醛2種。其中首次在包包曲中檢出的物質(zhì)包括：戊醛、2-甲基戊醛、巴豆醛、(E)-2-戊烯醛、庚醛、2-己烯醛、辛醛、(E,E)-2,6-壬二烯醛、(E)-2-癸烯醛、(E,Z)-2,4-癸二烯醛。按面積歸一法定量，己醛含量最高（相對(duì)峰面積比為7%），其次為2-庚烯醛（3%）、戊醛（2%）、3-甲基丁醛（1%）以及壬醛（1%）。

表3 包包曲中的游離醛類化合物

飽和醛類物質(zhì)包括3-甲基丁醛（異戊醛）、戊醛、2-甲基戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛。這類物質(zhì)主要呈現(xiàn)花香、水果香、青草味等香氣，對(duì)包包曲的整體香氣具有明顯的貢獻(xiàn)，在46%vol酒精水溶液中的閾值分別為17 μg/L、725 μg/L、33 μg/L（40%vol）[15]、25 μg/L、410 μg/L、40 μg/L、122 μg/L和71 μg/L。

包包曲中含有大量的不飽和醛，這些物質(zhì)在包包曲的香氣貢獻(xiàn)上具有至關(guān)重要的作用，其可能來源于多不飽和油脂在加熱條件下的氧化[16]。

2.3.4 呋喃類

共檢出21種呋喃類化合物（表4），其中首次在包包曲中檢出的物質(zhì)有：2-甲基四氫呋喃-3-酮、3-糠醛、3-甲基-4-戊內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、3-甲基-4-丁內(nèi)酯、5-甲基-2-呋喃甲醇、2(5H)-呋喃酮、四氫糠醇、(+/-)-β-羥基-γ-丁內(nèi)酯、泛酰內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯、4-甲基-5,6-二氫吡喃-2-酮、2-乙基-4-羥基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮、2,3-二氫苯并呋喃。由面積歸一法定量結(jié)果，2-甲基四氫呋喃-3-酮含量最高（相對(duì)峰面積比為3%），其次為(+/-)-β-羥基-γ-丁內(nèi)酯（3%）、糠醛（2%）、糠醇（1%），以及泛酰內(nèi)酯（1%）。

表4 包包曲中的游離呋喃類化合物

呋喃類化合物是白酒中一類重要的呈香化合物，并具有功能性，這類化合物是一類含氧的五元雜環(huán)物質(zhì)，主要呈現(xiàn)典型的焦香味。其中，糠醇、糠醛以及2-乙?；秽徽J(rèn)為是白酒中重要的呋喃類物質(zhì)[17]。

內(nèi)酯類化合物是一類特殊的呋喃類物質(zhì)，主要呈現(xiàn)果香、米香、甜香等香氣特征，本研究共檢出8種，包括3-甲基-4-戊內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、3-甲基-4-丁內(nèi)酯、丁內(nèi)酯、γ-己內(nèi)酯、(+/-)-β-羥基-γ-丁內(nèi)酯、泛酰內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯。

2.3.5 硫化物

本研究共檢出硫化物7種（表5），首次在包包曲中檢出的物質(zhì)有：噻唑、四氫噻吩-3-酮、2-乙?；邕?、苯并噻唑。含量最高的硫化物為2-乙?；邕颍ㄏ鄬?duì)峰面積比為2%），其次為3-甲硫基丙醛（1%）、苯并噻唑（1%）、二甲基三硫（0.24%）以及二甲基二硫（0.22%）。

表5 包包曲中的游離含硫化合物

硫化物在白酒中含量非常低，但是由于其具有更低的閾值和強(qiáng)烈的氣味，使得這類化合物在白酒的風(fēng)味中具有極其重要的地位[18]。一般來說，硫化物的風(fēng)味具有雙重作用，即濃度較低時(shí)，對(duì)白酒的風(fēng)味起著積極的促進(jìn)作用，而濃度較高時(shí)，則會(huì)對(duì)白酒的風(fēng)味造成不利的影響[13]。這類物質(zhì)一般呈現(xiàn)洋蔥、臭雞蛋、爛白菜等異嗅味。其中2-乙酰基噻唑呈堅(jiān)果、烘焙香氣，在水中的嗅覺閾值低至1 μg/L。3-甲硫基丙醛是飲料酒中最常見的甲硫基醛類物質(zhì)，呈土豆氣味；苯并噻唑呈橡膠、汽油氣味；二甲基三硫呈腐臭、爛白菜味，并且氣味閾值極低；二甲基二硫具有明顯的大蒜氣味，它們?cè)?6%vol酒精水溶液中的嗅覺閾值分別為 7.12 μg/L、50 μg/L、0.36 μg/L和9.13 μg/L。硫化物的極低含量以及特殊性質(zhì)為其鑒定工作造成了一定困難。本研究提供了一種可鑒定白酒生產(chǎn)過程樣品的硫化物的方法。

2.3.6 醇類

包包曲中檢測(cè)出的醇類物質(zhì)種類最多（34種，表6），包括直鏈醇10種、支鏈醇10種、不飽和醇11種以及多元醇3種。首次在包包曲中檢出的醇類物質(zhì)包括：2-甲基-3-丁烯-2-醇、3-甲基-2-丁醇、2-丙基-1-戊醇、1-戊烯-3-醇、3-戊烯-2-醇、(Z)-2-丁烯-1-醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、2-癸醇、乙二醇乙醚、異戊烯醇、(E)-2-己烯-1-醇、(Z)-2-己烯-1-醇、5-己烯-1-醇、6-氨基-1-己醇、2-丙基-1-庚醇、1-癸醇、(S)-(-)-1,2,4-丁三醇、十二醇、乙二醇單十二烷基醚。根據(jù)面積歸一法定量結(jié)果可知，2-丙基-1-庚醇的含量最高（相對(duì)峰面積比為4%），其次為3-甲基丁醇（3%）、1-己醇（3%）、1-戊醇（2%）。

表6 包包曲中的游離醇類化合物

醇類物質(zhì)是賦予白酒特殊口感的一類重要的風(fēng)味化合物，味覺上來說多數(shù)具有甜味，而氣味上來說則各不相同。有研究表明，2-丁醇、3-甲基丁醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇對(duì)濃香、清香、醬香3種香型白酒的酒曲香氣都具有一定的貢獻(xiàn)[19]，這幾種重要的醇類物質(zhì)在本研究中均被檢出。其中2-乙基-1-己醇在濃香型白酒大曲中的香氣強(qiáng)度最大，呈現(xiàn)典型的青草香；3-甲基丁醇（異戊醇）具有醇香、水果香，是白酒中雜醇油的主要成分之一。2-丁醇對(duì)清香型白酒大曲的香氣貢獻(xiàn)較明顯，呈現(xiàn)典型的花果香；1-壬醇呈黃瓜香氣，對(duì)濃香、清香、醬香3種香型白酒大曲的香氣都有一定的貢獻(xiàn)。

除此之外，1-辛烯-3-醇具有強(qiáng)烈的蘑菇味、土腥味，在46% vol酒精水溶液中的閾值僅6.12 μg/L，對(duì)白酒具有重要的香氣貢獻(xiàn)；前期研究中也在白酒大曲中檢測(cè)到該物質(zhì)，并推斷該物質(zhì)與大曲的霉味具有一定的關(guān)聯(lián)性[4]。

3 結(jié)論

本研究采用清蒸法獲得了五糧液生產(chǎn)用包包曲粉中的游離香氣成分，再利用SPE結(jié)合GC×GCTOFMS技術(shù)共鑒定出揮發(fā)性化合物209種，其中有68種物質(zhì)為首次在包包曲中發(fā)現(xiàn)，這些物質(zhì)大多數(shù)已經(jīng)被證明是白酒中重要的香氣貢獻(xiàn)物質(zhì)。采用的方法結(jié)合了SPE的選擇性吸附及GC×GCTOFMS的高掃描速度與自動(dòng)的解卷積功能，可在包包曲中發(fā)掘更多的微量成分。