基于主成分和聚類分析的鹿茸加工技術(shù)研究

田 晏，黃曉莉，侯召華

（齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）食品科學與工程學院，山東濟南 250353）

鹿茸是我國傳統(tǒng)的名貴中藥藥材，其藥理作用寬泛、化學成分復(fù)雜，被稱作天然的生長因子庫。研究表明，鹿茸中含有無機元素、氨基酸、脂質(zhì)類、芳香族化合物、酶類、多胺、糖類、維生素、激素、核酸、堿基、生長因子等多種有效成分[1?4]，其中氨基酸占總成分一半以上，具有抗炎、抗氧化、壯腎陽、益精血、強筋骨、調(diào)沖任等功效[5]。鹿茸是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能夠完全再生的哺乳動物器官[6?9]，因此也成為廣大科研工作者研究的對象。

鹿茸豐富的營養(yǎng)成分決定其品質(zhì)特性，但不同加工技術(shù)又影響其成分變化，品質(zhì)也隨之改變。因其價格昂貴，鹿茸干燥處理的效果將直接影響鹿茸的品質(zhì)和經(jīng)濟效益。干燥方式的選擇也成為鹿茸加工產(chǎn)地的重要環(huán)節(jié)，目前鹿茸的加工方式應(yīng)用較為廣泛的是傳統(tǒng)的煮炸干燥技術(shù)和先進的冷凍干燥技術(shù)。煮炸鹿茸需經(jīng)過沸水煮炸、烘烤等高溫工序，有效成分可能會流失；凍干鹿茸是在低溫干燥條件下，通過凍干機使新鮮的鹿茸冷凍干燥從而得到干制品。冷凍干燥法最大程度的保留了鹿茸中有效成分的活性，在市場擁有較為廣闊的前景[10?12]。

鹿茸加工品質(zhì)是選擇鹿茸加工方法的重要依據(jù)，包括基礎(chǔ)營養(yǎng)成分、膽固醇、氨基酸、脂肪酸、礦物質(zhì)等多項評價指標。如何科學、客觀的評價鹿茸加工品質(zhì)是目前需要解決的問題。近年來許多學者采用主成分分析[13]和聚類分析[14]對肉雞[15]、鬼燈檠屬[16]、蘋果[17]等動植物及中藥材進行了綜合評價。在鹿茸品質(zhì)分析和綜合評價方面，已有學者就梅花鹿鹿茸[18]、鹿茸飲片[19]、不同等級鹿茸[20]進行了基于主成分分析或聚類分析的綜合評價，但未見對不同加工方式的鹿茸品質(zhì)的綜合評價方面的詳細報道。因此，本文以煮炸干燥鹿茸和冷凍干燥鹿茸為材料，通過測定上述鹿茸成分指標，結(jié)合主成分分析和聚類分析法綜合評價鹿茸品質(zhì)，為今后鹿茸開發(fā)加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹿茸 中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所左家試驗站提供；甲酯化脂肪酸（37 種脂肪酸，F(xiàn)AMEs）混標 美國Nu-Chek Prep 公司；膽固醇 Sigma 公司；乙腈、甲醇 色譜級，F(xiàn)isher 公司；氯仿、甲醇、鹽酸、氯化鉀、氫氧化鉀、正己烷、無水硫酸鈉 均為分析純，天津廣成化學試劑有限公司。

GZX-9140MBE 數(shù)顯鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司；EYELA FDU-1100 真空冷凍干燥器日本東京理化公司；BFM-6B1 貝利粉碎機 濟南倍力粉技術(shù)工程有限公司；FW-200 高速萬能粉碎機北京中興偉業(yè)儀器有限公司；ME204E 萬分之一天平梅特勒-托利多儀器上海有限公司；Spe-ed SPEprime 型二氧化碳（CO2）超臨界萃取儀 美國應(yīng)用分離公司；ACQUITY UPLCTM超高壓液相色譜儀 沃特世科技上海有限公司；7000B 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 安捷倫科技中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 參照侯召華等[21]的實驗方法，隨機選取一對新鮮鹿茸，一支采用真空冷凍干燥法干燥，另一支采用傳統(tǒng)煮炸法干燥，實驗重復(fù)三次。

凍干鹿茸：將新鮮鹿茸茸體枝干的彎曲部分、嘴頭等處用排針扎孔，以避免凍干時茸頭表皮膨脹現(xiàn)象；鹿茸放于?80 ℃冰箱中預(yù)冷8 h 后，將冷凍的鹿茸表面用干凈毛巾擦拭干凈；然后把樣品放到真空冷凍干燥箱中真空冷凍干燥36 h；干燥室內(nèi)真空度控制在（10±5）Pa，溫度為（?45±5）℃。

煮炸干燥鹿茸：將新鮮帶血茸封鋸口，收茸后鋸口向上以免茸血流失；洗刷茸皮時鋸口不得沾水，洗刷鹿茸后將其鋸口撒上一層面粉，待面粉浸濕后用烙鐵燒烙鋸口將血眼堵??；封口鹿茸沸水煮炸30～40 s 后用紗布擦干，于75 ℃烘箱中干燥3 h，然后懸掛風干。前5 d 重復(fù)此工藝，第6 d 開始每2 d 一次，重復(fù)6～8 次，干燥為止。

冷凍干燥鹿茸和煮炸干燥鹿茸切小塊，貝利粉碎機粉碎，過60 目篩，得粉末備用。

1.2.2 鹿茸水分、灰分、脂肪、蛋白含量測定 水分和灰分：參照《中國藥典》2015 年版對不同加工方式干燥的三對鹿茸的水分、總灰分含量進行測定；粗脂肪、粗蛋白均按照國標規(guī)定標準進行檢測,其中脂肪含量測定參照GB/T5009.6-2016《食品中脂肪的測定》，蛋白質(zhì)含量測定參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》。

1.2.3 鹿茸膽固醇分析 膽固醇含量參照侯召華等[21]的方法測定。鹿茸脂溶性提取物溶解在20 mL 正己烷中，吸取1 mL 樣品液放到50 mL 水解管中，添加10 mL 1 mol/L KOH 水溶液和10 mL 乙醇。90～95 °C水浴下皂化90 min。皂化結(jié)束后流動水降溫，利用10 mL 正己烷萃取膽固醇，重復(fù)三次，合并萃取液。利用（3×10）mL 蒸餾水萃取液沖洗三次。氮氣吹干，重新溶解在10 mL 無水乙醇中，準備進行UPLC 分析。

根據(jù)GB 50319—2000《建設(shè)工程監(jiān)理規(guī)范》，所謂的監(jiān)理實施細則是根據(jù)監(jiān)理規(guī)劃的要求，由相關(guān)專業(yè)監(jiān)理工程師編寫，并經(jīng)總監(jiān)理工程師批準，針對工程項目中某一專業(yè)或某一方面監(jiān)理工作的操作性文件。它應(yīng)滿足以下幾項要求：

色譜條件：超高壓液相色譜ACQUITY UPLCTM，色譜柱：Acquity BEH-C18TM（100 mm×2.1 mm,1.7 μm, Waters），吸光值為203 nm，上樣量2 μL；柱溫箱45 °C；流動相A 為90%甲醇，B 為水；流動相為恒流A:B=90:10，流速0.5 mL/min。

式中：M 表示膽固醇含量，mg/100 g；c 表示樣品濃度，mg/mL；V 表示供試品溶液體積，mL；m 表示鹿茸取樣量，g；100 表示換算關(guān)系。

1.2.4 鹿茸脂肪酸組成分析 脂肪酸甲酯化方法參考文獻[22]，并進行適當修改。稱取鹿茸粉（約1.0 g）放到玻璃容器中，添加40 mL 提取液（氯仿:甲醇=2:1）；組織勻漿，超聲提取30 min 后，濾紙過濾，濾液放到分液漏斗中；然后添加30 mL 1 mol/L KCl 水溶液，4 ℃下靜置分層過夜。過夜分層后，得到下層有機相，氮氣吹干得到脂質(zhì)提取物；脂質(zhì)提取物溶解在5 mL 正己烷中，放到具塞試管中；在試管中添加5 mL 1 mol/L KOH 甲醇溶液，50 ℃下，反應(yīng)2 h；反應(yīng)結(jié)束后，添加5 mL 正己烷和15 mL 5% HCl 溶液，進行分層；上層為有機相（正己烷層），得到上層相，用正己烷定容至10 mL；然后加入無水Na2SO4除去多余水分。取進樣量1 μL，進行GC-MS 分析。

氣相色譜條件：色譜柱：SPTM-2560 彈性石英毛細管柱（100 m×0.25 mm×0.25 μm; supelco, PA）；升溫程序：140 ℃保持5 min，以4 ℃/min 升至200 ℃，接著3 ℃/min 升至220 ℃，保持26 min；載氣（He）流速1.0 mL/min；進樣量1 μL；分流比為60:1。進樣口溫度和傳輸線溫度為250 ℃。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度280 ℃；全掃描方式，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～500。鹿茸中脂肪酸含量表示為mg/100 g。

式中：W 表示脂肪酸含量，mg/100 g；c 表示樣品濃度，mg/mL；V 表示供試品溶液體積，mL；m 表示鹿茸取樣量，g；100 表示換算關(guān)系。

1.2.5 鹿茸氨基酸成分分析 參考唐曉雷等[23]測定方法，并進行適當修改。取一定量樣品于20 mL 水解管中，加入6 mol /L 鹽酸溶液16 mL，真空脫氣30 min，充氮封管，110 ℃下水解22 h，冷卻后打開水解管，用去離子水無損轉(zhuǎn)移到50 mL 容量瓶中，定容。準確取1 mL 水解液于小瓶中，于真空中脫酸抽干，加1 mL 水再抽干，再加1 mL 水再抽干備用。添加0.02 mol /L 鹽酸溶液1 mL，充分溶解。精密量取上述溶液 500 μL，置于5 mL 塑料離心管中，添加1 mol /L三乙胺乙腈溶液 250 μL，混勻，添加0.1 mol /L 異硫氰酸苯酯乙腈溶液250 μL，混勻，室溫放置1 h，加2 mL 正己烷，劇烈振搖，放置10 min，取下層溶液用0.22 μm 的水相膜濾膜過濾后上機分析。色譜柱：Aglient Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；柱溫：40 ℃；檢測波長254 nm; 流動相A：0.1 mol /L醋酸鈉緩沖液（pH6.5）-乙腈（93:7）；流動相B：乙腈-水（8:2）；梯度為恒流，流動相B 為50%；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

1.2.6 礦物質(zhì)元素測定 參考王燕華等[24]的測定方法。K、Ca、Na、Fe 用原子吸收光譜法測定；Mg、Cu、Zn、Mn 用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）測定。稱取樣品0.5 g 放置于聚四氟乙烯內(nèi)罐中，加入5 mL 硝酸，浸泡20 min，再加入2～3 mL 過氧化氫，放置10 min，蓋上內(nèi)蓋，安裝好保護套，將消解罐放入微波消解儀器內(nèi)，設(shè)置微波消解程序，進行消解。消解結(jié)束后，取出內(nèi)罐，將內(nèi)罐中的消解液用水少量洗滌并轉(zhuǎn)移到50 mL 容量瓶中，定容，混勻，進樣分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)營養(yǎng)成分與膽固醇分析

由表1 可知，煮炸鹿茸與凍干鹿茸的含水量分別為（11.20±1.11）、（5.37±0.12）mg/100 g，煮炸鹿茸中含水量極顯著高于凍干鹿茸（P<0.01）。含水量將直接影響成品鹿茸外觀、質(zhì)量等品質(zhì)，含水量過高導致鹿茸在自身酶和外界腐敗菌的作用下降低藥用價值。真空冷凍干燥技術(shù)使新鮮鹿茸在干燥的過程中不受表面張力的作用，成品不變形，脫水徹底，便于長期貯存、運輸和利用。不同加工方式的鹿茸樣品中，常規(guī)營養(yǎng)成分含量存在差異，凍干鹿茸中粗灰分、粗脂肪、粗蛋白以及膽固醇含量均高于煮炸鹿茸，但并不顯著（P>0.05）。說明凍干鹿茸能較好的保留其營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)。

表1 不同加工方式鹿茸中的營養(yǎng)成分和膽固醇Table 1 Nutrient composition and cholesterol in antler velvet of different processing methods

2.2 脂肪酸分析

由表2 可知，煮炸鹿茸和凍干鹿茸測定有19 種脂肪酸，總脂肪酸含量分別為（105.70±9.25）、（146.48±10.53）mg/100 g，差異極顯著（P<0.01）。其中以硬脂酸（32.35%和34.30%），油酸（13.66%和8.51%），棕櫚酸（16.87%和18.75%）為主，單不飽和酸（MUFA）以油酸突出，多不飽和脂肪酸（PUFA）以亞油酸、花生四烯酸較為突出。研究表明，以油酸為代表的單不飽和脂肪酸，具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂等功效，同時降低低密度脂蛋白水平，有利于血管的軟化，具有防治心血管疾病的療效[25]，且與二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）發(fā)揮協(xié)同作用增強其功效[26?27]。

表2 不同加工方式鹿茸的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of antler velvet processed in different processing methods

2.3 氨基酸組成

由表3 可知，煮炸干燥鹿茸、真空冷凍干燥鹿茸中氨基酸總量分別為（32.59±0.44）、（34.11±0.98）mg/100 g，差異極顯著（P<0.01）。兩種加工方式的鹿茸中均含有17 種氨基酸，凍干鹿茸和煮炸鹿茸中含量最多的氨基酸依次是甘氨酸（占氨基酸總量的14%～16%）、谷氨酸（占氨基酸總量的11%～13%）和脯氨酸（占氨基酸總量的9%～10%）。蛋氨酸、半胱氨酸含量較低。凍干鹿茸中蘇氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等人體必需氨基酸，谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等呈味氨基酸含量顯著高于煮炸鹿茸（P<0.05），說明在真空冷凍干燥加工過程中，鹿茸中氨基酸及香味物質(zhì)得到最大程度地保留。

表3 不同加工方式鹿茸的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of antler velvet processed in different processing methods

2.4 礦物質(zhì)組成

由表4 可知，煮炸鹿茸與凍干鹿茸中8 種礦物質(zhì)總量分別為（163403.97±9765.35）、（157948.14±6803.63）mg/kg，煮炸鹿茸中礦物質(zhì)含量高于凍干鹿茸，但不顯著(P>0.05)。在兩種鹿茸4 種常量元素中，Ca 含量均為最高，Mg 含量均為最低；4 種微量元素中，F(xiàn)e 含量均為最高，Cu 含量均為最低。煮炸鹿茸中的礦物質(zhì)含量高于凍干鹿茸，這與王燕華[28]的研究結(jié)論一致。

表4 不同加工方式鹿茸的礦物質(zhì)組成Table 4 Mineral composition of antler velvet processed in different processing methods

2.5 主成分分析

主成分分析（principal component analysis）是一種通過數(shù)據(jù)降維，將多個變量通過線性變換為少數(shù)綜合變量，用簡化的數(shù)據(jù)反映原始數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計分析方法[29]。主成分分析方法保留了原指標的大部分信息，比單一評價更方便準確，同時避免性狀間的相關(guān)性對評價結(jié)果的影響[30]。在對不同加工方式的鹿茸品質(zhì)進行評價時，不能只從一項指標和幾項指標的優(yōu)劣性考慮，而應(yīng)該考慮到所有指標，對鹿茸進行科學、系統(tǒng)的綜合評價。本文以2 種加工方式鹿茸的49項指標構(gòu)成矩陣，采用SPSS 26.0 軟件進行PCA。

圖1 是主成分分析特征值碎石圖，橫軸表示主成分數(shù)量，縱軸表示特征值。本試驗綜合考慮了碎石圖和方差貢獻率確定最優(yōu)主成分數(shù)。由圖1 可知，主成分分析特征值碎石圖有三個拐點，即表明有三個主成分。由表5 可得出，主成分1 的貢獻率為45.80%，主成分2 的貢獻率為20.80%，主成分3 的貢獻率為14.27%，前3 個主成分累計方差貢獻率達到80.87%，綜合了鹿茸品質(zhì)指標的大部分信息。由表6 可知，第一主成分PC1 主要包含了Behenic acid（二十二烷酸）、Lignoceric acid（二十四烷酸）、Arachidic acid（花生酸）等的信息，且均為正相關(guān)，即在以PC1 為橫坐標的正向，PC1 越大，Behenic acid、Lignoceric acid、Arachidic acid 均越大，PC1 可命名為脂肪酸因子。第二主成分PC2 主要包含Mn、Zn、Fe 的信息，且Mn 和Fe 呈正相關(guān)，Zn 呈負相關(guān)，即PC2 越大，Mn 和Fe 越大，Zn 越小。PC2 可命名為必需微量元素因子。第三主成分PC3 主要包含了Pro（脯氨酸）、Arg（精氨酸）、Gly（甘氨酸）的信息，其中Pro、Arg、Gly 均為正相關(guān)，即PC3 越大，Pro、Arg、Gly 越大。PC3 可命名為氨基酸因子。

圖1 主成分分析特征值碎石圖Fig.1 Principal component analysis feature root gravel

表5 鹿茸品質(zhì)評價因子的特征值和貢獻率Table 5 The characteristic value and contribution rate of deer antlers quality evaluation factor

表6 旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣Table 6 A rotated composition matrix

應(yīng)用PCA 對煮炸鹿茸和凍干鹿茸樣本進行檢驗，可看出兩組可以完全分開，兩組之間具有明顯差異，需分析兩組之間的差異代謝物。如圖2 所示，圓點表示真空干燥組，菱形點表示煮炸干燥組。

圖2 PCA 得分圖Fig.2 PCA scoreboard

2.6 聚類分析

火山圖（volcano plot）是一種可以表示組間差異數(shù)據(jù)的圖像，有兩個重要參數(shù)，即顯著性和差異表達。顯著性（p-value）是差異性檢驗兩組的P值，差異表達一般按照fold change（倍數(shù)變化）表示，利用P值<0.05 和log2 大于1 或者小于?1 來篩選指標，即可篩選出顯著差異表達的鹿茸成分，從而進一步分析[31]。圖中每一個點代表一個指標，實心圓形和空心三角形為顯著上調(diào)表達的指標，實心正方形為顯著下調(diào)表達的指標，空心正方形為無顯著性差異的指標。

圖3 為兩種加工技術(shù)差異表達指標的火山圖，其中橫軸代表log2（fold change）值，縱軸代表-log10（p-value）值。尋找其中明顯上調(diào)或下調(diào)的16 個差異成分，主要為水、氨基酸和脂肪酸成分。統(tǒng)計得到煮炸鹿茸中1 種成分含量高于凍干鹿茸；凍干鹿茸中15 種成分含量高于煮炸鹿茸，由于煮炸鹿茸和凍干鹿茸自身的差異較大，篩選的差異成分可用來區(qū)分煮炸鹿茸和凍干鹿茸。

圖3 煮炸和冷凍干燥鹿茸成分差異火山圖Fig.3 Volcanic map of composition difference of boiled and freeze-dried velvet antler

聚類分析（cluster analysis）是研究樣品或指標分類問題的一種統(tǒng)計方法，目的是在相似的基礎(chǔ)上收集數(shù)據(jù)來分類，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域[32]。為進一步確定不同方式加工的鹿茸中成分差異，對16 種差異成分進行層次聚類分析，并繪制樣品中差異成分含量的熱圖，圖中每一行代表一個成分指標，每一列為一個樣本，不同顏色表示不同的表達量，結(jié)果如圖4。通過歐式距離法進行聚類分析，把16 種成分分成2 簇，脂肪酸和氨基酸為一類，且在凍干鹿茸中含量極顯著高于煮炸鹿茸（P<0.01）；水分含量為一類，且在煮炸鹿茸中含量極顯著高于凍干鹿茸（P<0.01）。結(jié)果表明，不同加工方式鹿茸的成分組成差異明顯。

圖4 煮炸和冷凍干燥鹿茸中差異成分聚類分析Fig.4 Cluster analysis of different components in boiled and freeze-dried velvet antler

3 結(jié)論

對兩種加工技術(shù)研究表明，真空冷凍干燥和傳統(tǒng)煮炸法干燥對鹿茸營養(yǎng)成分組成和含量影響顯著；真空冷凍干燥加工技術(shù)能有效保留鹿茸中脂溶性成分和氨基酸含量，脂肪酸和氨基酸含量極顯著高于煮炸干燥鹿茸（P<0.01）；而水分含量凍干鹿茸極顯著低于煮炸干燥鹿茸（P<0.01），這表明真空冷凍干燥技術(shù)能有效脫去鹿茸中水分。利用主成分分析研究兩種加工技術(shù)鹿茸產(chǎn)品中理化指標的差異和潛在相關(guān)性，3 個主成分（脂肪酸因子、無機元素因子、氨基酸因子）包括了鹿茸產(chǎn)品品質(zhì)的多個指標，能客觀地反映加工方式對主成分的影響，表明真空冷凍技術(shù)對脂溶性成分具有顯著影響。對兩種鹿茸產(chǎn)品中16 個顯著差異成分進行聚類分析，最終聚2 簇，一類是氨基酸與脂肪酸，一類是水分含量。本研究主要集中對不同方式加工的鹿茸中氨基酸、脂肪酸等營養(yǎng)成分進行系統(tǒng)研究，闡明真空冷凍干燥法和煮炸干燥法的鹿茸加工品質(zhì)的差異，為鹿茸的開發(fā)加工利用提供數(shù)據(jù)支撐。在后續(xù)研究過程中，應(yīng)加強對鹿茸中性激素、游離氨基酸、游離脂肪酸等功效成分的研究。