同位素稀釋-高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測定乳及乳制品中3 種三嗪類農(nóng)藥

李 巧，戴 唯，王 緬，朱 明

（貴陽海關(guān)綜合技術(shù)中心，貴州貴陽 550081）

三嗪類農(nóng)藥是一種廣泛用于玉米、黃瓜等農(nóng)作物生產(chǎn)的農(nóng)藥，在使用過程中可能對土壤、農(nóng)作物、地表水和其他飲用水源造成污染，也可通過食物鏈在生物體內(nèi)蓄積，影響人體內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能，甚至導(dǎo)致人類癌癥或先天性缺陷[1?6]。本文研究的滅蠅胺、莠去津和異丙甲草胺其性質(zhì)和作用各不相同：滅蠅胺（Cyromazine）是一種三嗪類昆蟲生長調(diào)節(jié)劑，可誘導(dǎo)昆蟲形態(tài)發(fā)生畸變[7]，在農(nóng)作物生長過程中會降解代謝產(chǎn)生三聚氰胺等有害化學物質(zhì)[8]；莠去津（Atrazine）又名阿特拉津，是一種成本低，使用廣泛的三嗪類除草劑，其水溶性強、半衰期長，在水中不可降解, 對動物和水生生物的生殖發(fā)育存在毒害作用，對人體有潛在致癌、致畸、致突變的作用[9?11]；異丙甲草胺（Metolachlor）又名都爾，是一種活性高、用量少、選擇性強、低毒除草劑，是我國獲得登記使用的農(nóng)藥除草劑之一[12?13]。我國出口的食品中滅蠅胺、莠去津、異丙甲草胺均因殘留問題被歐盟、美國、日本等國家發(fā)布預(yù)警通告，說明我國對這三種農(nóng)藥的把控不夠嚴格，可能對我國食品的出口和人民的健康造成一定影響[14?19]。

自2008 年“三聚氰胺事件”發(fā)生以來，乳及乳制品的食品安全問題一直是社會研究的熱點，引起廣大人民及相關(guān)政府機構(gòu)的重視[20]，針對乳及乳制品中農(nóng)藥殘留限量，國家標準GB 2763-2019 《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》 也做了相應(yīng)的增加，但相對于發(fā)達國家和地區(qū)還有不足。如歐盟對乳及乳制品中滅蠅胺、異丙甲草胺限量值為10 μg/kg[21]，莠去津則采用“一律標準”10 μg/kg[22]；美國對乳及乳制品中滅蠅胺、莠去津、異丙甲草胺限量值分別為：50、20、20 μg/kg；日本對乳及乳制品中滅蠅胺、莠去津的限量值為10 、10 μg/kg，異丙甲草胺采用“一律標準”10 μg/kg[23]；而我國僅對生乳中滅蠅胺作出10 μg/kg 限量規(guī)定。目前，乳及乳制品中農(nóng)藥殘留的檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜法[24?25]、液相色譜-質(zhì)譜法[26]、氣相色譜法[27]、薄層分析法[28]等；其中滅蠅胺的檢測方法有分子印跡液相色譜法[29]、液相色譜-質(zhì)譜法[30]等，莠去津常用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[30?32]、氣相色譜法[33]等，異丙甲草胺多采用氣相色譜-質(zhì)譜法[34]等。對乳及乳制品的凈化方式多使用凝膠滲透色譜（GPC）[13,30]，如李鵬等[30]研究的同位素稀釋-高效液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜法測定總膳食乳類樣品中8 種三嗪類農(nóng)藥,雖都使用同位素稀釋-高分辨質(zhì)譜，但凈化方法復(fù)雜繁瑣。因此本文選擇滅蠅按、莠去津、異丙甲草胺為研究對象，C18固相萃取小柱凈化，建立了乳及乳制品中3 種三嗪類農(nóng)藥的檢測方法。

高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜因其高選擇性的四級桿和高分辨率、高靈敏度的軌道阱相結(jié)合，能夠快速篩查目標物。它與三重四級桿低分辨質(zhì)譜相比較，不用對目標物逐個離子及相關(guān)參數(shù)進行優(yōu)化，通過提供母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)，從而準確推算可能的分子式[35?36]。同位素內(nèi)標因其與對應(yīng)化合物有相同的物理化學性質(zhì)，當樣品前處理和定量測定過程中有所損失時，相當量的內(nèi)標物有補償和校正作用，使得定量方法更為準確[37]。因此本文根據(jù)乳及乳制品的特點，以各目標化合物對應(yīng)的同位素為內(nèi)標，建立一種精準定性和準確定量的檢測方法，為保障我國乳及乳制品的食品安全提供了有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

奶粉、牛奶、酸奶 市售；莠去津 標準品，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；滅蠅胺 上海安譜實驗科技股份有限公司；異丙甲草胺 北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；莠去津同位素-D5、滅蠅胺同位素-13C3、異丙甲草胺同位素-D6 北京曼哈格生物科技有限公司；乙腈、甲醇 色譜純，德國Merck 公司；氯化鈉 農(nóng)殘級，山東西亞化學工業(yè)有限公司；無水硫酸鈉 農(nóng)殘級，北京百靈威科技有限公司；甲酸 色譜純，上海安譜科技有限公司；SPE C18（500 mg, 6 mL）固相萃取柱、SPE NH2（500 mg, 6 mL）固相萃取柱 天津博納艾杰爾科技有限公司；SPE HLB （200 mg, 6 mL）固相萃取柱、ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱 美國沃特世公司；Hypersil GOLD C18色譜柱 美國賽默飛世爾科技公司。

Dionex UltiMate 3000 高效液相色譜儀、高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive ThermoFisher 公司；渦旋振蕩器 Heidolph 公司；高速離心機 美國貝克曼公司；超聲提取儀 Elmasonic 公司；Turbo Vap LV 氮吹儀 美國 Biotage 公司；ME802E電子天平瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q 超純水機 美國Millipore 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制 準確吸取濃度為100 μg/mL 的滅蠅胺、莠去津、異丙甲草胺標準品各100 μL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，混勻后得濃度為1.0 μg/mL 的中間混合液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫粶蚀_吸取濃度為100 μg/mL 的滅蠅胺、莠去津、異丙甲草胺同位素內(nèi)標各100 μL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，混勻后得濃度為1.0 μg/mL 的同位素內(nèi)標中間混和液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。標準曲線的配制：分別吸取外標混標10、20、50、100、200、500 μL，同位素內(nèi)標混標20 μL 于10 mL 容量瓶中，得到濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL,含同位素內(nèi)標2.0 ng/mL 的標準曲線。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm, 1.9 μm）, 流動相：0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）梯度洗脫條件：0～1.5 min,95%A, 1.5～7.0 min, 5%A, 7.0～8.5 min, 5%A, 8.5～8.51 min, 95%A, 8.51～10.0 min, 95%A, 整個分析流程共10 min。進樣體積：10 μL，柱溫35 ℃。

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子源：質(zhì)譜采用加熱HESI 源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：Full MS/dd-MS2；毛細管溫度：325 ℃；噴霧電壓：3000 V；吹掃氣溫度：350 ℃。一級質(zhì)譜分辨率為70000，二級質(zhì)譜分辨率為17500；歸一化碰撞能量（NCE）為40、60 和80 eV，掃描范圍：50～300 m/z。

1.2.4 樣品前處理

1.2.4.1 樣品提取 準確稱取樣品5 g（精確到0.01 g）于50 mL 聚丙烯離心管中，加入40 μL 濃度為1.0 μg/mL 內(nèi)標中間液體，再加20 mL 乙腈，混勻后用30 ℃水浴超聲提取10 min，依次加入1.0 g 氯化鈉和5.0 g 無水硫酸鈉，渦旋震蕩5.0 min，10000 r/min 離心，待凈化。

1.2.4.2 凈化 用5 mL 甲醇，5 mL 水活化C18固相萃取柱，待液面到達篩板時，迅速取1 mL 提取液上柱，待液體浸出凈化柱后，再取1 mL 提取液上柱，收集流出液過0.2 μm 濾膜上機測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Xcalibur 軟件進行數(shù)據(jù)的采集及處理；本文所用數(shù)據(jù)平行及重復(fù)次數(shù)、數(shù)據(jù)表示形式、統(tǒng)計學分析方法、顯著性水平均采用“統(tǒng)計計算”及Excel軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜及色譜條件的確定

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 三嗪類農(nóng)藥具有堿性氮原子，可以結(jié)合氫離子形成正離子，因此本試驗在正離子模式下，采用Full MS/dd-MS2掃描模式，利用一級質(zhì)譜全掃描以確定目標化合物的精確質(zhì)量數(shù)（5 ppm）和保留時間，設(shè)定掃描范圍（50～300 m/z），同時設(shè)定目標物列表，采用自動觸發(fā)二級質(zhì)譜模式，以獲得3 種化合物的二級質(zhì)譜圖，確定其精確二級碎片離子。以一級母離子定量，一級母離子和精確二級質(zhì)譜碎片離子定性，內(nèi)標化合物提高定量和定性的準確度。濃度為100 ng/mL，3 種三嗪類農(nóng)藥色譜法及離子碎片圖見圖1；3 種三嗪類農(nóng)藥及其內(nèi)標分子式、結(jié)構(gòu)式、保留時間、母離子、離子碎片見表1。

表1 3 種三嗪類農(nóng)藥及其內(nèi)標分子式、保留時間、母離子、離子碎片、結(jié)構(gòu)式Table 1 Three kinds of triazine pesticides and their internal molecular formula, retention time, parent ion, ion fragment and structural formula

圖1 3 種三嗪類農(nóng)藥的色譜峰及離子碎片圖Fig.1 Chromatographic peaks and ion fragment profiles of three triazines

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

2.1.2.1 流動相的優(yōu)化 分別比較了甲醇、乙腈作為有機相，水、0.1%甲酸作為水相時的分離度和響應(yīng)值，如圖2 所示。當目標化合物濃度為50 ng/mL時，不同流動相對3 種三嗪類農(nóng)藥響應(yīng)值的影響。其中目標物在0.1%（v/v）時甲酸體系中響應(yīng)較高?？赡苁且驗槟繕宋镌谡x子模式下電離，而甲酸有利于目標物電離形成正離子，可以顯著提高離子化效率[38]；有機相為甲醇時，化合物莠去津和滅蠅胺響應(yīng)較高，雖然異丙甲草胺在乙腈體系的流動相中響應(yīng)較高，但綜合考慮到甲醇價格較便宜，且毒性較低，最終選擇0.1%（v/v）甲酸-甲醇作為流動相。

圖2 不同流動相對3 種三嗪類農(nóng)藥響應(yīng)值的影響Fig.2 Effects of different types of the mobile phase on response values of three triazine pesticides

2.1.2.2 色譜柱的優(yōu)化 滅蠅胺、莠去津、異丙甲草胺均屬于極性化合物，ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱是極性分析首選柱，增強對極性分子的反相保留；Hypersil GOLD C18色譜柱對極性樣品也具有良好的保留值和分離度。因此實驗選擇Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm, 1.9 μm）和ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm,1.8 μm）進行分析比較。實驗結(jié)果表明，在Hypersil GOLD C18色譜柱和ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱上均得到優(yōu)異的色譜峰形，保留時間分布均勻，重現(xiàn)性好，在Hypersil GOLD C18色譜柱上，滅蠅胺保留時間（0.9 min）相對靠后，綜合考慮滅蠅胺和異丙甲草胺在Hypersil GOLD C18色譜柱上響應(yīng)值較高（見圖3），所以最終選擇Hypersil GOLD C18色譜柱進行試驗分析。

圖3 不同色譜柱對3 種三嗪類農(nóng)藥響應(yīng)值的影響Fig.3 Effect of different chromatographic columns on response values of three triazine pesticides

2.2 樣品前處理條件的選擇

2.2.1 提取條件的選擇 目前乳及乳制品農(nóng)藥多殘留分析中，提取溶劑大多采用乙腈、三氯乙酸和乙酸溶液[39?41]。本實驗以奶粉為基質(zhì)，分別考察了乙腈、1%三氯乙酸乙腈溶液和2%乙酸溶液的提取效果的差異，當提取溶劑為乙腈時，雜峰干擾較小，3 種三嗪農(nóng)藥回收率在74.8%～102%。三氯乙酸作為提取溶劑時，樣品中滅蠅胺保留時間與標準溶液相比有較長延遲，可能是由于氯的吸電子誘導(dǎo)效應(yīng)，羧酸上的電荷向氯的方向轉(zhuǎn)移，降低了羧酸上氧的電荷密度，使氫離子更容易解離，酸性增強，因此不采用；用2%乙酸提取時，有輕微雜峰，且回收率為17.4%～59.0%，綜合考慮選擇乙腈作為提取試劑，詳見圖4～圖6。

圖4 不同提取劑對莠去津的影響Fig.4 Effects of different solvents on atrazine

圖6 不同提取劑對異丙甲草胺的影響Fig.6 Effects of different solvents on metolachlor

2.2.2 樣品凈化條件的確定 結(jié)合文獻[42?45]，本文選擇C18固相萃取柱、NH2固相萃取柱和HLB 固相萃取柱對乳及乳制品進行凈化，并比較分析。結(jié)果表明，C18柱效吸附樣品中的雜質(zhì)，凈化效果良好，回收率為97.8%～103.0%，因此本實驗采用C18柱作為凈化柱。三種固相萃取柱對3 種三嗪類農(nóng)藥的影響見圖7。

圖7 不同凈化柱對3 種三嗪類農(nóng)藥的影響Fig.7 Effects of different purification columns on three triazine pesticides

2.2.3 內(nèi)標法和外標法定量差異比較 準確稱取5.00 g 牛奶試樣于50 mL 離心管中，分別加入100 μL濃度為1.0 μg/mL 的混合標準溶液和40 μL 濃度為1.0 μg/mL 的滅蠅胺-13C3、莠去津-D5、異丙甲草胺-D6 內(nèi)標中間混合溶液；另取5.00 g 牛奶試樣于50 mL 離心管中，只加入100 μL 濃度為1.0 μg/mL的混合標準溶液，兩組試樣按照1.2.4 節(jié)提取和凈化步驟進行試驗，結(jié)果為表2，由表2 可知，用內(nèi)標法測試樣品時，回收率更好，因此本實驗采用內(nèi)標法測定。

表2 內(nèi)標法和外標法差異比較Table 2 Comparison between internal standard method and external standard method

圖5 不同提取劑對滅蠅胺的影響Fig.5 Effects of different solvents on cyromazine

2.3 線性相關(guān)性、回收率、精密度、檢出限

2.3.1 檢出限 按照1.2.4 節(jié)的前處理方法對牛奶、奶粉及酸奶樣品進行處理，向空白樣品中添加不同水平濃度的目標化合物，以信噪比（S/N）≥3 對應(yīng)的添加水平作為檢出限（limit of detection, LOD），3 種三嗪類農(nóng)藥的檢測限為5 μg/kg。

2.3.2 線性相關(guān)性、回收率、精密度 選取空白樣品（牛奶、奶粉及酸奶）分別做3 個濃度的添加回收實驗，每個添加水平做6 個平行樣品，添加水平為5、10、25 μg/kg。結(jié)果表明3 種三嗪類農(nóng)藥的平均回收率為81.6%～104.0%，相對標準偏差為0.55%～4.14%。3 種三嗪類農(nóng)藥的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、回收率和相對標準偏差詳見表3。

表3 3 種三嗪類農(nóng)藥的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Linear equations, correlation coefficients, standard recoveries and relative standard deviations of three triazine pesticides（n=6）

3 結(jié)論

采用乙腈提取，經(jīng)C18固相萃取小柱凈化，同位素內(nèi)標法定量，建立了同位素稀釋-高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測定乳及乳制品中3 種三嗪類農(nóng)藥的方法。方法前處理簡單，靈敏度高，線性關(guān)系、回收率、精密度等均滿足方法學指標，檢出限為5 μg/kg，滿足歐盟（滅蠅胺、異丙甲草胺及莠去津限量值為10 μg/kg）、日本（滅蠅胺、異丙甲草胺及莠去津限量值為10 μg/kg）、美國（滅蠅胺、莠去津、異丙甲草胺限量值分別為：50、20、20 μg/kg）等國家和地區(qū)的限量要求[21,46?47]，為保障我國乳及乳制品的食品安全提供了技術(shù)支撐，彌補了我國與發(fā)達國家因農(nóng)殘法規(guī)差異性帶來檢測項目的不足。