LAMA4、FHIT及P16水平變化與肝癌患者病情嚴(yán)重程度的關(guān)系①

黃 勇 王小敏 周海娟 李表清 許政衡 李枝錦④ （?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院檢驗科，海口 570216）

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤，已成為是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因［1］。多數(shù)肝癌患者確診時已處于晚期，其進(jìn)展速度快，治療難度大，患者預(yù)后普遍較差，早診斷、早治療是提高肝癌患者生存率的最佳手段。目前臨床主要通過甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）血清學(xué)檢測聯(lián)合影像學(xué)CT、MRI等對高危人群進(jìn)行篩查，但該檢測方法較難鑒別良性病變與肝癌［2］，因此急需尋找更加敏感或特異的生物標(biāo)志物。層黏連蛋白α4亞基（laminin alpha4，LAMA4）是層黏連蛋白的重要功能亞基，可促進(jìn)各種細(xì)胞的遷移、增殖、存活，影響癌癥細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，LAMA4在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制LAMA4表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡［3］。脆性組氨酸三聯(lián)體（fragile histidine triad，F(xiàn)HIT）是一種存在于大多數(shù)正常細(xì)胞、組織內(nèi)抑癌基因，可調(diào)控細(xì)胞周期、阻止細(xì)胞有絲分裂、抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT水平升高可抑制肝癌細(xì)胞增殖，提升原發(fā)性肝癌患者的近期生存率［4］。P16也是一種抑癌基因，可抑制細(xì)胞周期依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）與細(xì)胞周期蛋白（cyclin）結(jié)合，阻止有絲分裂，抑制細(xì)胞周期，影響基底膜合成，猜測可能與LAMA4表達(dá)相關(guān)［5］。研究顯示，P16在肝癌組織中表達(dá)水平低于癌旁組織，且在肝癌組織中FHIT與P16表達(dá)呈正相關(guān)，二者有望成為臨床檢測的新指標(biāo)［6］。本研究旨在探討LAMA4、FHIT及P16水平在不同嚴(yán)重程度肝癌患者的組織及血清中的變化，以期找到更加敏感、特異的肝癌生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 資料 選取2020年9月至2021年4月在?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院進(jìn)行肝癌手術(shù)治療的120例患者作為研究對象，其中男76例，女44例，年齡40～65歲，平均年齡（53.15±8.64）歲。按照分化程度分為：高分化38例，中分化45例，低分化37例；按照TNM分期分為：Ⅰ期23例，Ⅱ期49例，Ⅲ期48例；按照是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移99例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次確診為原發(fā)性肝癌者；②手術(shù)前未接受放、化療治療；③臨床資料完善；④患者及家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無法接受手術(shù)治療者；②合并其他器官系統(tǒng)疾病者；③繼發(fā)性肝癌患者。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 組織樣本采集：于術(shù)中采集所有患者切除的組織樣本，距離肝癌組織≥5 cm為遠(yuǎn)肝癌組織組，共80例；距離肝癌組織1～2 cm為癌旁組織組，共80例；手術(shù)切除的肝癌組織為肝癌組織組，共120例，所得組織樣本用生理鹽水清洗后，去除壞死組織，存放置標(biāo)本管中，將所得樣本組織分為兩部分，一部分制備石蠟切片進(jìn)行免疫組化檢測，另一部分快速冷凍后于-80℃冰箱保存，用于qRT-PCR檢測。

血清樣本采集：術(shù)前一天采集所有患者的空腹肘靜脈血5 ml，3 500 r/min離心10 min，收集上層血清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 qRT-PCR法檢測組織中LAMA4、FHIT及P16 mRNA水平 取出冰箱中保存的組織樣本，采用TRIzol法提取組織總RNA。所提取的RNA經(jīng)紫外分光光度儀測定總RNA濃度和純度，符合要求后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以所得cDNA為模板制備qRTPCR反應(yīng)體系（20μl），qRT-PCR反應(yīng)在CFX Connect熒光定量PCR儀上進(jìn)行。采用2-ΔΔCt法計算LAMA4、FHIT及P16 mRNA水平。LAMA4、FHIT、P16及內(nèi)參β-actin的引物序列見表1。

表1 LAMA4、FHIT、P16及內(nèi)參β-actin的引物序列Tab.1 Primer sequences of LAMA4，F(xiàn)HIT，P16 and internal referenceβ-actin

1.2.3 ELISA法檢測血清中LAMA4、FHIT及P16水平 采用包被有LAMA4、FHIT、P16抗原的8連管檢測肝癌患者血清中LAMA4、FHIT、P16蛋白的水平，具體步驟按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料如LAMA4、FHIT、P16水平等以±s描述，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以［n（%）］描述，行χ2檢驗。采用Pearson法分析肝癌組織與血清中LAMA4、FHIT、P16的相關(guān)性，Spearman法分析LAMA4、FHIT、P16表達(dá)水平與肝癌患者病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化典型圖像 如圖1所示，LAMA4蛋白在肝癌組織中呈高表達(dá)，F(xiàn)HIT、P16蛋白在肝癌組織中呈低表達(dá)。

圖1 肝癌組織中LAMA4、FHIT、P16免疫組織化學(xué)圖像（×400）Fig.1 Immunohistochemical images of LAMA4，F(xiàn)HIT and P16 in hepatocellular carcinoma（×400）

2.2 肝癌患者不同組織中LAMA4、FHIT及P16mRNA水平比較 與遠(yuǎn)肝癌組織組比較，癌旁組織組、肝癌組織組LAMA4 mRNA水平較高，F(xiàn)HIT及P16 mRNA水平較低（P＜0.05）；與癌旁組織組比較，肝癌組織組LAMA4 mRNA水平較高，F(xiàn)HIT及P16 mRNA水平較低（P＜0.05）。見表2。

表2 肝癌患者不同組織中LAMA4、FHIT及P16 mRNA水平比較（±s）Tab.2 Comparison of mRNA levels of LAMA4，F(xiàn)HIT and P16 in different tissues of patients with liver cancer（±s）

表2 肝癌患者不同組織中LAMA4、FHIT及P16 mRNA水平比較（±s）Tab.2 Comparison of mRNA levels of LAMA4，F(xiàn)HIT and P16 in different tissues of patients with liver cancer（±s）

Note：Compared with distal hepatocellular carcinoma tissue group，1）P＜0.05；compared with adjacent tissues group，2）P＜0.05.

Groups Distal hepatocellular carcinomatissue（n=80）Adjacent tissues（n=80）Liver cancer tissue（n=120）FP LAMA4 mRNA 1.02±0.05 1.31±0.361）1.84±0.521）2）154.643＜0.001 FHIT mRNA 1.01±0.06 0.86±0.181）0.61±0.201）2）193.421＜0.001 P16 mRNA 0.99±0.04 0.82±0.211）0.57±0.191）2）196.430＜0.001

2.3 血清LAMA4、FHIT及P16水平與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系 如表3所示，不同年齡、性別的肝癌患者血清LAMA4、FHIT及P16水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與高分化患者比較，中分化、低分化患者血清LAMA4水平較高，F(xiàn)HIT及P16水平較低（P＜0.05）；與中分化患者比較，低分化患者血清LAMA4水平較高，F(xiàn)HIT及P16水平較低（P＜0.05）。與Ⅰ期患者比較，Ⅱ期、Ⅲ期患者血清LAMA4水平較高，F(xiàn)HIT及P16水平較低（P＜0.05）；與Ⅱ期患者比較，Ⅲ期患者血清LAMA4水平較高，F(xiàn)HIT及P16水平較低（P＜0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清LAMA4高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者，F(xiàn)HIT及P16水平低于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）。

表3 血清LAMA4、FHIT及P16水平與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系（±s）Tab.3 Relationship between serum LAMA4，F(xiàn)HIT and P16 levels and clinicopathological features in patients with hepatocellular carcinoma（±s）

表3 血清LAMA4、FHIT及P16水平與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系（±s）Tab.3 Relationship between serum LAMA4，F(xiàn)HIT and P16 levels and clinicopathological features in patients with hepatocellular carcinoma（±s）

Note：Compared with high differentiation，1）P＜0.05；compared with moderately differentiation，2）P＜0.05；compared withⅠperiod patients，3）P＜0.05；compared withⅡperiod patients，4）P＜0.05.

Groups Age＜55 year≥55 year Gender Male Female Differentiated degree High differentiation Moderately differentiated Poorly differentiated TNMⅠⅡⅢLymphatic metastasis No Yes n 69 51 76 44 38 45 37 23 49 48 99 21 LAMA4/（μg·L-1）169.27±52.33 175.18±52.49 168.52±51.83 176.24±52.71 145.70±46.31 172.64±51.371）201.26±60.151）2）137.82±48.61 170.59±52.333）192.87±56.493）4）164.85±42.17 196.44±50.23 F/t 0.611 0.781 10.395 8.369 3.013 P 0.543 0.436＜0.001＜0.001 0.003 FHIT/（μg·L-1）237.73±48.35 241.37±46.68 237.98±47.69 240.70±48.52 278.34±49.16 240.22±45.191）195.72±39.481）2）274.92±50.39 246.15±47.323）213.60±42.583）4）250.81±46.39 216.48±45.91 F/t 0.414 0.299 31.852 14.859 3.086 P 0.680 0.765＜0.001＜0.001 0.003 P16/（μg·L-1）26.77±4.62 25.38±4.57 26.59±4.49 25.18±4.73 30.47±4.82 26.17±4.681）21.43±3.851）2）31.25±5.04 27.46±4.813）20.28±4.573）4）27.02±4.73 20.68±4.31 F/t 1.637 1.626 38.043 49.760 5.661 P 0.104 0.107＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 肝癌組織及血清中LAMA4、FHIT及P16的相關(guān)性分析 Pearson法相關(guān)性分析顯示，肝癌患者組織中LAMA4與血清LAMA4表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.616，P＜0.001），癌組織中FHIT與血清FHIT表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.517，P＜0.001），癌組織中P16水平與血清P16水平呈正相關(guān)（r=0.552，P＜0.001）。見圖2。

圖2 肝癌組織及血清中LAMA4、FHIT、P16的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of LAMA4，F(xiàn)HIT，P16 in liver cancer tissues and serum

2.5 LAMA4、FHIT及P16水平與肝癌患者病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肝癌患者血清LAMA4水平與分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)（P＜0.05），血清FHIT、P16水平均與分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表4。

表4 LAMA4、FHIT及P16水平與肝癌患者病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between LAMA4，F(xiàn)HIT and P16 levels and severity of liver cancer patients

3 討論

肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，其病因尚不明確。該病起病較隱匿，早期無明顯癥狀，患者就診時多處于中晚期，盡管治療手段不斷進(jìn)步，但肝癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率仍較高，預(yù)后差。探索肝癌相關(guān)分子機(jī)制，可能為診斷及治療肝癌提供新方向。

層黏連蛋白是基底膜中重要的非膠原糖蛋白，LAMA4是層黏連蛋白的α4鏈，是一種異源三聚體糖蛋白，參與誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，且在細(xì)胞遷移、傷口愈合和血管形成等過程中發(fā)揮作用［7-8］。腫瘤在轉(zhuǎn)移過程中，往往從基底膜屏障開始突破，侵襲鄰近組織，進(jìn)而向遠(yuǎn)端組織轉(zhuǎn)移，正常且完整的基底膜可阻止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲。層黏連蛋白對于維持基底膜的完整性、固定腫瘤細(xì)胞具有重要作用，其表達(dá)或結(jié)構(gòu)異?？蓪?dǎo)致腫瘤微環(huán)境異常，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。馬麗萍等［3］研究證實，LAMA4在肝癌細(xì)胞中mRNA及蛋白水平均上調(diào)，抑制其表達(dá)，癌細(xì)胞凋亡率增加，LAMA4可影響肝癌細(xì)胞免疫逃逸和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，LAMA4在乳腺癌中過表達(dá)，其過表達(dá)標(biāo)志著癌前病變向惡性癌癥的轉(zhuǎn)變，敲除LAMA4可抑制體外乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［9］。本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織和遠(yuǎn)癌組織相比，肝癌組織中LAMA4 mRNA水平較高，與上述結(jié)果相似，提示LAMA4過表達(dá)可能通過改變腫瘤微環(huán)境促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮促癌作用。進(jìn)一步分析顯示，高分化、中分化、低分化患者血清LAMA4水平依次升高，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者血清LAMA4水平依次升高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清LAMA4水平高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者，且血清LAMA4水平與分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)，提示LAMA4水平隨著患者病情加重而升高，監(jiān)測血清LAMA4水平可能有助于肝癌患者的早期發(fā)現(xiàn)及病情診斷。

FHIT基因位于染色體脆弱位點FRA3B，是人類癌癥中最常缺失的基因之一，即使在輕微的復(fù)制壓力下該位點也可能發(fā)生斷裂或形成間隙。研究表明，F(xiàn)HIT蛋白可保護(hù)大多數(shù)組織正常細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性，避免細(xì)胞內(nèi)在和外在DNA的損傷［10］。FHIT丟失可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定、細(xì)胞凋亡和DNA損傷等，F(xiàn)HIT蛋白表達(dá)的喪失或降低與腫瘤進(jìn)展、不良預(yù)后有關(guān)［11］。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT在肝癌組織中水平低于癌旁組織，其表達(dá)與患者腫瘤分期、分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)，F(xiàn)HIT低表達(dá)對肝癌患者的癌變進(jìn)展具有刺激作用，或可成為肝癌患者預(yù)后的陰性指標(biāo)［12］。趙鵬偉等［13］研究表明，原發(fā)性肝癌患者癌組織中FHIT表達(dá)上升，F(xiàn)HIT是影響原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的危險因素，其水平可預(yù)測患者術(shù)后3年的生存狀況。本研究中，與癌旁組織和遠(yuǎn)癌組織相比，肝癌組織中FHITmRNA水平較低，與既往研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清FHIT水平與肝癌患者分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈負(fù)相關(guān)，證實FHIT水平與肝癌患者的疾病進(jìn)展有關(guān)。

P16是重要的抑癌基因，在多種癌癥中異常表達(dá)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，且其表達(dá)失活可導(dǎo)致癌細(xì)胞過度分化、增殖，使得細(xì)胞分泌的降解基底膜物質(zhì)增多，基底膜合成受到阻礙，可能與層黏連蛋白表達(dá)有一定的關(guān)聯(lián)［14］。P16通過調(diào)節(jié)CDK4與cyclinD1結(jié)合，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，細(xì)胞中P16變異失活，可導(dǎo)致細(xì)胞過度繁殖，甚至癌變［15］。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中P16蛋白陽性率低于癌旁3 cm組織，且P16水平與肝癌患者轉(zhuǎn)移、門靜脈癌栓形成等惡性發(fā)展有關(guān)［16］。鄭香偉［17］研究表明，肝癌患者癌組織中P16及FHIT蛋白陽性率低于癌旁組織及遠(yuǎn)癌組織，P16蛋白陽性率與腫瘤大小、分化程度有關(guān)，且在癌組織、癌旁組織及遠(yuǎn)癌組織中P16及FHIT蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)。本研究中，與癌旁組織和遠(yuǎn)癌組織相比，肝癌組織中P16 mRNA水平較低，可能是由于肝癌患者癌組織中P16發(fā)生變異失活，導(dǎo)致癌細(xì)胞過度增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清P16水平與肝癌患者分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，提示監(jiān)測P16水平可能對肝癌惡性進(jìn)展有一定的預(yù)測作用。此外，有研究指出肝癌組織中FHIT與P16表達(dá)呈正相關(guān)［6］，本研究中未對二者的相關(guān)性進(jìn)行探討，但在不同嚴(yán)重程度的肝癌患者中，血清FHIT與P16水平變化呈相同趨勢，二者可能在肝癌患者中共同發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，肝癌患者組織及血清中LAMA4高表達(dá)，F(xiàn)HIT、P16低表達(dá)，LAMA4作為促癌基因，F(xiàn)HIT、P16作為抑癌基因，均與肝癌患者分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)。血清LAMA4、FHIT及P16水平均有望成為臨床檢查的新指標(biāo)，為臨床診斷提供新的方法。本研究缺乏LAMA4、FHIT及P16對患者預(yù)后的影響，日后將對患者進(jìn)行隨訪，并探討其與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系。