miR-216a-5p在HMGB1介導(dǎo)的表皮葡萄球菌感染致腹膜透析相關(guān)腹膜炎中的作用

賈 磊，劉 冰，李衛(wèi)光

(1. 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院醫(yī)院感染管理辦公室，山東 濟(jì)南 250021； 2. 山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250021)

全世界每年有超過10萬(wàn)終末期腎病患者接受腹膜透析治療，約占透析總?cè)藬?shù)的10%～15%[1]。我國(guó)腹膜透析患者每年呈15%以上的速度增長(zhǎng)，新增患者近8 000人/年[2]。腹膜透析并發(fā)癥中以腹膜透析相關(guān)腹膜炎(peritoneal dialysis-associated peritonitis，PDAP)最為常見，而表皮葡萄球菌感染是導(dǎo)致PDAP的主要原因之一。高遷移率蛋白B1(high mobility group protein-B1，HMGB1)是一種高度保守的核蛋白，也是一種晚期重要炎癥介質(zhì)。研究[3]表明，HMGB1抑制劑(甘草素)治療可顯著降低脂多糖大鼠的死亡率，而PDAP患者腹膜透析液中HMGB1表達(dá)升高[4]，提示HMGB1可能在PDAP發(fā)生及發(fā)展中起著一定的作用。MicroRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，已經(jīng)成為許多疾病的治療靶點(diǎn)[5]。大量研究[6-7]提示，miR-216a-5p在非小細(xì)胞肺癌、哮喘等疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。前期我們通過生信預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-216a-5p與HMGB1存在相互結(jié)合，但目前miR-216a-5p是否通過調(diào)控HMGB1參與表皮葡萄球菌感染致PDAP發(fā)生發(fā)展，尚缺乏研究。本研究建立表皮葡萄球菌感染致PDAP的小鼠模型，并使用甘草素和miR-216a-5p mimics進(jìn)行干預(yù)，探究抑制HMGB1對(duì)表皮葡萄球菌感染致PDAP的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 60只健康雄性C57BL/6J小鼠，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因素-α(TNF-α)、HMGB1、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、核轉(zhuǎn)錄因子抑制蛋白(I-κB)抗體，購(gòu)自中國(guó)Proteintech公司；引物、miR-216a-5p mimics、陰性對(duì)照miR-216a-5p NC及雙熒光素酶HMGB1野生和突變載體，購(gòu)自中國(guó)GenePharma公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 建模及分組 成年雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分組。對(duì)照組：腹腔注射生理鹽水200 μL。感染組：腹腔注射表皮葡萄球菌溶液107CFU/mL(用3.86%透析液稀釋108/mL的表皮葡萄球菌菌株)[8]，建立表皮葡萄球菌感染致PDAP小鼠模型后注射生理鹽水200 μL。感染+HMGB1抑制劑組：腹腔注射表皮葡萄球菌溶液107CFU/mL+腹腔注射甘草素(15 mg/kg，溶于200 μL生理鹽水)。感染+miR-216a-5p mimics組：腹腔注射表皮葡萄球菌溶液107CFU/mL+尾部靜脈注射miR-216a-5p mimics(3 mg/kg，溶于200 μL生理鹽水)，每組15只。

1.2.2 腹腔積液白細(xì)胞計(jì)數(shù)、標(biāo)本采集 藥物干預(yù)48 h后麻醉小鼠，腹腔內(nèi)注射1 mL腹膜透析液，2 h 后切開小鼠腹部，留取腹膜透析液，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)腹腔積液白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。取腹膜組織，部分4%多聚甲醛固定，部分液氮保存。

1.2.3 免疫組化染色 冰凍切片65℃烤片，二甲苯脫蠟，乙醇水化；0.01 mol/L的枸櫞酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，靜置冷卻到室溫，過氧化氫酶溶液孵育10 min，PBS清洗，山羊血清封閉30 min，滴加一抗4℃孵育過夜。次日切片恢復(fù)室溫，PBS清洗，加生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液室溫孵育30 min，DAB試劑顯色，流水沖洗終止顯色，脫水風(fēng)干后，中性樹膠封片，顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)基因表達(dá) 使用Trizol試劑按說明書提取總RNA。依據(jù)PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用Light Cycler 480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 PCR檢測(cè)引物序列

1.2.5 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取凍存組織，按說明書提取各組總蛋白。用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確定蛋白上樣量。蛋白樣品經(jīng)過SDS-PAGE電泳濃縮分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1～2 h，一抗4℃過夜孵育。主要抗體如下：anti-IL-1α(1∶600)、anti-IL-6(1∶1 000)、anti-TNF-α(1∶1 000)、anti-HMGB1(1∶1 500)、anti-NF-κB(1∶2 000)、anti-I-κB(1∶2 000)。TBST洗膜，然后用HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜。電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑曝光顯影。以β-actin作為內(nèi)參，使用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 構(gòu)建HMGB1的野生型(WT)和突變型(MUT)雙熒光素酶報(bào)告載體。使用Lipofectamin 3000將報(bào)告基因質(zhì)粒與miR-216a-5p mimics或miR-216a-5p NC共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 表皮葡萄球菌感染致PDAP情況 對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，進(jìn)食飲水、活動(dòng)正常；感染組、感染+HMGB1抑制劑組、感染+miR-216a-5p mimics組小鼠精神狀態(tài)欠佳、活動(dòng)相對(duì)減少、進(jìn)食飲水無明顯異常。動(dòng)物試驗(yàn)過程中，4組小鼠體重、心率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，4組均無死亡。感染組小鼠腹腔積液白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。HE染色顯示，對(duì)照組小鼠腹膜組織無炎性浸潤(rùn)現(xiàn)象，腹膜組織結(jié)構(gòu)完整；感染組小鼠腹膜出現(xiàn)明顯的炎癥浸潤(rùn)，炎癥細(xì)胞增多(見圖1a)。免疫組織化學(xué)染色顯示，感染組IL-1α比對(duì)照組增多(均P<0.05)(見圖1b)；Western Blot和Real-time PCR結(jié)果顯示，感染組IL-1α、IL-6、TNF-α的蛋白和mRNA的表達(dá)均高于對(duì)照組(均P<0.05)(見圖1c, 1d)。

表2 各組小鼠腹腔積液白細(xì)胞計(jì)數(shù)情況

2.2 HMGB1在PDAP的作用 免疫組織化學(xué)染色、Western Blot和Real-time PCR結(jié)果顯示，感染組HMGB1表達(dá)均高于對(duì)照組(均P<0.05)(見圖1b～d)。與感染組相比，感染+HMGB1抑制劑組HE染色顯示炎性浸潤(rùn)改善，炎癥細(xì)胞減少；免疫組織化學(xué)染色顯示IL-1α表達(dá)下降(P<0.05)；Real-time PCR和Western Blot結(jié)果均提示IL-1α、IL-6、TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)下降(均P<0.05)(見圖1b～d)。Western Blot結(jié)果顯示，感染組NF-κB蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組、感染+HMGB1抑制劑組(均P<0.05)；感染組I-κB蛋白的表達(dá)低于對(duì)照組、感染+HMGB1抑制劑組(均P<0.05)(見圖1e)。

a：HE染色觀察腹膜組織炎性浸潤(rùn)情況(×400)；b：免疫組化染色圖(×400)；c：Western Blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)情況；d：Real-time PCR 檢測(cè)mRNA表達(dá)情況；e：NF-κB、I-κB蛋白表達(dá)情況；*表示感染組與對(duì)照組相比，P<0.05；#表示感染+HMGB1抑制劑組與感染組相比，P<0.05。

2.3 miR-216a-5p靶向HMGB1參與PDAP情況 Real-time PCR結(jié)果顯示，感染組miR-216a-5p較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)(見圖2a)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-216a-5p mimics可顯著抑制HMGB1野生報(bào)告基因質(zhì)粒(HMGB1-WT)組熒光素酶活性，而HMGB1-3’UTR區(qū)突變(HMGB1-MUT)后未受影響，提示miR-216a-5p 可直接作用于HMGB1的3’UTR區(qū)(見圖2b～c)。Real-time PCR結(jié)果顯示，感染+miR-216a-5p mimics組較對(duì)照組明顯升高，轉(zhuǎn)染效率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖2d)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，感染+miR-216a-5p mimics組HMGB1表達(dá)較感染組減弱(P<0.05)(見圖2e)；Real-time PCR和Western Blot結(jié)果顯示，感染+miR-216a-5p mimics組HMGB1 mRNA和蛋白的表達(dá)均較感染組下降(均P<0.05)(見圖2f～g)。

a：Real-time PCR檢測(cè)miR-216a-5p的表達(dá)水平；b：HMGB1 3’UTR與miR-216a-5p互補(bǔ)序列；c：雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果；d：miR-216a-5p mimincs的轉(zhuǎn)染效率；e：HMGB1免疫組化染色圖(×400)；f：Western Blot 檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá)情況； g：Real-time PCR 檢測(cè)HMGB1 mRNA表達(dá)水平；*表示與對(duì)照組相比，P<0.05；#表示與感染組相比，P<0.05。

3 討論

慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)發(fā)病率逐年升高，全球患病率約為13.4%[9]，我國(guó)患病率約為10.8%[10]，部分患者進(jìn)展至終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)，需要接受腎替代治療，其中腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是主要替代治療方法之一。PDAP是腹膜透析的常見并發(fā)癥，也是腹膜透析患者死亡的主要原因之一[11-13]。

研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，PDAP主要以革蘭陽(yáng)性菌感染為主，其中又以表皮葡萄球菌居多。表皮葡萄球菌是一種凝固酶陰性的條件致病菌，廣泛存在于人體皮膚和黏膜表面，其導(dǎo)致的感染常與換液操作不規(guī)范和污染有關(guān)。研究[8]發(fā)現(xiàn)，表皮葡萄球菌最易在腹膜透析管內(nèi)形成細(xì)菌生物膜，抗菌藥物難以清除，從而造成腹膜炎復(fù)發(fā)，影響患者治療與預(yù)后。但目前關(guān)于表皮葡萄球菌感染致PDAP的發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

HMGB1是一種廣泛存在于真核細(xì)胞的核內(nèi)因子，同時(shí)也是一種重要的炎癥介質(zhì)，在不同急慢性免疫疾病中起重要作用[16]。HMGB1可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放，如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8，與炎癥過程密切相關(guān)[17]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，在大鼠腹腔局部注射HMGB1抑制劑可顯著減輕脂多糖引起的腹膜功能及腹膜形態(tài)損傷，提示HMGB1在腹膜炎發(fā)展中有著一定的作用，然而HMGB1是否與表皮葡萄球菌感染致PDAP有關(guān)，目前尚缺乏研究。本組研究發(fā)現(xiàn)，表皮葡萄球菌感染小鼠腹膜組織，HMGB1表達(dá)明顯升高，同時(shí)IL-1α、IL-6、TNF-α的表達(dá)也明顯增加；HMGB1抑制劑干預(yù)后，HMGB1、IL-1α、IL-6、TNF-α的表達(dá)降低，證實(shí)HMGB1在表皮葡萄球菌感染致PDAP中表達(dá)升高，同時(shí)參與調(diào)節(jié)IL-1α、IL-6、TNF-α的釋放。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)通路在乙型病毒性肝炎、戊型病毒性肝炎等感染性疾病，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥等炎癥疾病中發(fā)揮重要作用，其中包括HMGB1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[18-20]。I-κB的降解是NF-κB激活的重要標(biāo)志，隨著I-κB的降解，NF-κB的復(fù)合物被釋放到細(xì)胞核中，進(jìn)而激活NF-κB通路[21]。本研究發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌感染后NF-κB表達(dá)升高，I-κB表達(dá)降低；甘草素處理后逆轉(zhuǎn)NF-κB、I-κB表達(dá)，因此推測(cè)HMGB1可以通過影響NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)通路誘導(dǎo)IL-1α、IL-6、TNF-α的表達(dá)，參與表皮葡萄球菌感染致PDAP的發(fā)生。

MicroRNA是由大約20個(gè)左右核苷酸組成的一種非編碼、小RNA，通過靶向3’-UTR區(qū)抑制靶基因翻譯過程[22]，同時(shí)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化等多種細(xì)胞過程[23]。通過TargrtSacn和miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)miR-216a-5p和 HMGB1有相互作用位點(diǎn)，可能存在靶向作用關(guān)系，且雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)miR-216a-5p 可直接作用于HMGB1的3’UTR區(qū)。miR-216a被認(rèn)為是急性胰腺炎期間判斷胰腺損傷的重要血清生物標(biāo)志物[24]，通過介導(dǎo)不同的靶基因參與梅毒、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生[25-27]，通過抑制NF-κB通路的激活，抑制炎癥反應(yīng)[28]。本研究構(gòu)建miR-216a-5p過表達(dá)載體，證實(shí)miR-216a-5p可逆轉(zhuǎn)表皮葡萄球菌感染致PDAP HMGB1表達(dá)，推測(cè)miR-216a-5p是HMGB1的負(fù)性調(diào)控因子，通過調(diào)控HMGB1參與表皮葡萄球菌感染致PDAP。對(duì)于miR-216a-5p在PDAP中的作用及具體機(jī)制，仍需進(jìn)一步試驗(yàn)探討。

本研究各組小鼠均于藥物干預(yù)48 h后處死，并留取腹膜透析液和腹膜標(biāo)本用于研究。研究存在周期較短、未設(shè)置抗感染治療對(duì)照組，未能系統(tǒng)觀察HMGB1對(duì)表皮葡萄球菌感染致PDAP小鼠模型轉(zhuǎn)歸和預(yù)后的影響，未來將進(jìn)一步研究，為證實(shí)miR-216a-5p在HMGB1介導(dǎo)的表皮葡萄球菌感染致PDAP中的作用提供更為充分的試驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，表皮葡萄球菌感染可導(dǎo)致小鼠腹膜組織HMGB1、NF-κB的活化，并誘導(dǎo)炎癥因子IL-1α、IL-6、TNF-α表達(dá)水平增高，而HMBG1抑制劑可顯著刺激HMGB1、NF-kB的活化以及炎癥因子的表達(dá)；同時(shí)過表達(dá)miR-216-5p可明顯抑制HMGB1的表達(dá)。因此，推測(cè)HMGB1在表皮葡萄球菌感染致PDAP發(fā)揮重要作用，抑制HMGB1可明顯改善炎癥反應(yīng)，miR-216a-5p可通過靶向HMGB1參與表皮葡萄球菌感染致PDAP的發(fā)生，將為深入研究表皮葡萄球菌感染致PDAP的發(fā)生發(fā)展和治療提供試驗(yàn)依據(jù)。