乳源蠟樣芽胞桿菌耐藥性、毒力因子檢測(cè)及分子特征研究

郭佳， 王娉， 周繼福,3， 趙曉美， 劉繼鋒， 陳穎*

(1．天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457； 2．中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；3．南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210023)

蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)是一種革蘭氏陽性桿菌，廣泛存在于自然界和動(dòng)物腸道中，好氧、產(chǎn)芽胞，在8～55 ℃環(huán)境下均可生長，28～35 ℃是其最適生長溫度[1]，因此容易在食品生產(chǎn)、運(yùn)輸和銷售等環(huán)節(jié)繁殖而污染食品[2-4]。近10年來，每年都有由于蠟樣芽胞桿菌污染導(dǎo)致的食物中毒事件發(fā)生[5-7]。而乳制品中的污染情況也比較突出，對(duì)10年內(nèi)我國吉、閩、陜?nèi)∪槠菲髽I(yè)乳與乳制品中蠟樣芽孢桿菌的污染情況進(jìn)行調(diào)查與鑒定[8-11]，結(jié)果顯示，吉林省乳制品中蠟樣芽孢桿菌的檢出率為32.90%，其中長春市檢出率高達(dá)73.33%；福建省部分地區(qū)嬰幼兒奶粉檢出率也達(dá)到52.78%；陜西省乳與乳制品中的檢出率為20.00%。謝愛蓉等[12]對(duì)溫州市市售乳粉中蠟樣芽胞桿菌的污染情況及分離株的毒力基因進(jìn)行研究，蠟樣芽胞桿菌檢出率為19.00%，主要的腸毒素毒力基因?yàn)閚he基因與entFM基因。Dosanjos等[13]對(duì)巴西75份乳飲品進(jìn)行微生物學(xué)檢測(cè)，羊奶、豆奶和羊奶飲料的蠟樣芽胞桿菌檢出率分別為16%、52%和44%。由此表明，乳品中蠟樣芽胞桿菌污染具有普遍性。蠟樣芽孢桿菌可引起食物中毒，癥狀主要有腹瀉和嘔吐。蠟樣芽胞桿菌引起食物中毒的主要成分是其產(chǎn)生的兩種腸毒素——嘔吐毒素和腹瀉毒素，這兩種毒素能夠引起嘔吐型和腹瀉型食物中毒，嚴(yán)重者可能導(dǎo)致敗血癥、創(chuàng)傷、肺部感染和心內(nèi)膜炎等[14]。蠟樣芽孢桿菌含有多種毒力基因可轉(zhuǎn)錄翻譯成腸毒素，包括溶血素BL基因(hblA、hblC、hblD)、非溶血腸毒素基因(nheA、nheB、nheC)、細(xì)胞毒素K基因(cytK)[15]、腸毒素基因(bceT和entFM)和嘔吐毒素基因(ces和EM1)。其中，毒力最強(qiáng)的是引起嘔吐的毒素基因ces和EM1[16-17]。

目前，臨床主要采用抗生素治療蠟樣芽孢桿菌引發(fā)的食物中毒，但隨著藥物的濫用和耐藥元件的轉(zhuǎn)移，蠟樣芽孢桿菌對(duì)常見抗生素的耐藥性不斷增強(qiáng)。CLSI 標(biāo)準(zhǔn)M45-a2[18](苛養(yǎng)菌少見菌藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn))中推薦的蠟樣芽孢桿菌藥敏試驗(yàn)抗生素分為β-酰胺類和非β-酰胺類。由于蠟樣芽孢桿菌可以產(chǎn)生β-酰胺酶，因此，對(duì)β-酰胺類抗生素表現(xiàn)出高度耐藥[19]。本研究主要選擇9種非β-酰胺類抗生素(包括治療蠟樣芽胞桿菌感染的推薦用藥)，對(duì)乳及乳制品來源的122株蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，分析其主要毒力基因；并使用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)對(duì)蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行分型，以掌握原料乳及乳粉來源蠟樣芽孢桿菌的流行病學(xué)特征，為蠟樣芽孢桿菌引起的食源性疾病的預(yù)警、預(yù)防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

蠟樣芽孢桿菌ATCC 11778、ATCC 29213及沙門氏菌H9812為本實(shí)驗(yàn)室保存。122株蠟樣芽孢桿菌分離株均分離自原料乳及乳粉(來自于北京、河北及內(nèi)蒙古)，其中，49株為2019年原料乳分離株；25株為2016年乳粉分離株；37株為2017年乳粉分離株；11株為2018年乳粉分離株。均采用GB 4789.14—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》進(jìn)行鑒定。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)瓊脂、多粘菌素B，胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；水解酪蛋白瓊脂(MHA)培養(yǎng)基購于英國OXOID公司；dNTPs、ExTaq酶、10×ExTaq緩沖液、溴化乙錠、DL2000 DNA 標(biāo)記分子購于大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖(invitrogen)、哥倫比亞血瓊脂平板、慶大霉素(gentamicin，10 μg)、四環(huán)素(tetracycline，30 μg)、紅霉素(erythromycin，15 μg)、氯霉素(chloramphenicol，30 μg)、阿米卡星(amikacin，30 μg)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，5 μg)、克林霉素(clindamycin，2 μg)、復(fù)方新諾明(trimethoprim-sulfamethoxazole，1.25/23.75 μg)、利福平(rifampin，5 μg)購于英國Oxiod公司；MicrobankTM菌種保存管購于加拿大PRO-LAB公司；氯化鈉、DNA提取試劑盒來自于天根生化科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶XpaⅠ(15 U·μmol-1)、NotⅠ(15 U·μmol-1)、溶菌酶(15 U·μmol-1)來自于Takara公司；5×TBE、EDTA、Tris-HCl來自于索萊寶公司；Gel Red核酸染液來自于美國Biotium公司；引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 主要儀器和設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀(Veriti 96 Well Thermal Cycler)，美國AB公司；離心機(jī)(5804R)，德國Eppendorf公司；電泳儀(MODEL 200/2.0 POWER SUPPLY)，分子凝膠成像儀(VersaDoc)，PFGE凝膠電泳儀(CHEF MAPPER)，美國BIO-RAD公司；數(shù)顯拍擊式均質(zhì)機(jī)，法國Interscience公司；全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)(BD PhoenixTM-100)，美國BD公司；核酸蛋白分析儀(DU640)，德國Beckman公司。

1.4 毒力基因的檢測(cè)

使用DNA提取試劑盒提取蠟樣芽孢桿菌的基因組DNA，并用核酸蛋白分析儀對(duì)提取的細(xì)菌DNA濃度進(jìn)行測(cè)定后，將DNA稀釋至20 μg·mL-1作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的DNA模板，在-20 ℃下保存?zhèn)溆?。?duì)蠟樣芽孢桿菌的11個(gè)毒力相關(guān)基因(hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、entFM、cytK、bceT、ces、EMl)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：模板2 μL，引物各1 μL(引物序列見表1)，dNTPs 2 μL，10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)2.5 μL，ExTaq(5 U·μL-1)0.3 μL，ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃，10 min；95 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 蠟樣芽孢桿菌11個(gè)毒力基因的引物序列

1.5 蠟樣芽胞桿菌藥物敏感性分析

蠟樣芽孢桿菌的藥物敏感性檢測(cè)按照世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的K-B法進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)，參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)2020版[22]標(biāo)準(zhǔn)分為敏感(sensitivity，S)、耐藥(resistance，R)和中介(intermediary，I)。

1.6 脈沖凝膠電泳(pulsed-field gel electropho-resis，PFGE)分型分析

根據(jù)蠟樣芽孢桿菌PFGE規(guī)范[23]進(jìn)行操作，將細(xì)菌包埋至膠塊中，使用苯丁酸氮芥(chlorambucil，CLB)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行裂解。裂解后對(duì)膠塊進(jìn)行清洗、保存。然后對(duì)膠塊內(nèi)DNA進(jìn)行酶切并加樣、電泳。最后對(duì)電泳膠進(jìn)行染色、脫色、拍照，使用BioNumerics 6.6軟件對(duì)蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行聚類分析。采用非加權(quán)平均法構(gòu)建聚類圖，條帶位置差異容許度1.5%，使用Dice系數(shù)衡量圖形之間的相似度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用BioNumerics 6.6軟件進(jìn)行聚類分析，使用Origin.2018繪制圖，使用Excel.365繪制表格。

2 結(jié)果分析

2.1 毒力基因攜帶情況

對(duì)122株乳品來源的蠟樣芽孢桿菌攜帶的主要毒力因子進(jìn)行分析，結(jié)果(表2)表明，122株蠟樣芽孢桿菌都攜帶nheA、nheB和entFM基因； 99.90%的蠟樣芽孢桿菌都攜帶4個(gè)及以上毒力因子。99.18%的蠟樣芽孢桿菌攜帶nheC基因；37.70%的蠟樣芽孢桿菌攜帶bceT基因；31.15%的蠟樣芽孢桿菌攜帶cytK基因；29.51%的蠟樣芽孢桿菌攜帶hblA基因；24.59%的蠟樣芽孢桿菌攜帶hblC基因；8.20%的蠟樣芽孢桿菌攜帶hblD基因；6.56%的蠟樣芽孢桿菌攜帶ces基因；6.56%的蠟樣芽孢桿菌攜帶EM1基因。

表2 蠟樣芽孢桿菌攜帶的毒力因子

2.2 蠟樣芽胞桿菌分離株的耐藥性

122株蠟樣芽胞桿菌對(duì)9種非β-酰胺類抗生素的藥物耐受性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(圖1)表明，122株蠟樣芽胞桿菌均對(duì)氯霉素、慶大霉素、阿米卡星敏感；40株對(duì)利福平敏感；77株對(duì)利福平中介，中介率為63.11%；7株對(duì)紅霉素中介，中介率為5.74%；6株對(duì)克林霉素中介，中介率為4.92%；3株對(duì)復(fù)方新諾明中介，中介率為2.46%；1株對(duì)環(huán)丙沙星中介；1株對(duì)四環(huán)素中介；12株對(duì)復(fù)方新諾明耐藥，耐藥率為9.84%；10株對(duì)四環(huán)素耐藥，耐藥率為8.20%；5株對(duì)利福平耐藥，耐藥率為4.10%。122株蠟樣芽孢桿菌中耐藥比例為16.40%，其中，13株為單重耐藥株，7株為二重耐藥株，無多重耐藥株。耐藥譜型共6種，分別為：四環(huán)素、復(fù)方新諾明、利福平、四環(huán)素-復(fù)方新諾明、四環(huán)素-利福平、復(fù)方新諾明-利福平。流行的耐藥譜為復(fù)方新諾明和四環(huán)素-復(fù)方新諾明，分別占耐藥株的30%和25%，四環(huán)素-利福平耐藥株和復(fù)方新諾明-利福平耐藥株的比例為2%。

圖1 蠟樣芽孢桿菌對(duì)不同抗生素藥物敏感情況

2.3 蠟樣芽胞桿菌分離株的PFGE分子分型分析

使用NotⅠ對(duì)122株乳品來源的分離株進(jìn)行酶切，PFGE分型后得到15個(gè)簇、106個(gè)帶型，相似性在13.1%～100.0%，呈現(xiàn)出較高的基因多態(tài)性(圖2)。每個(gè)帶型包含1～3株菌，未發(fā)現(xiàn)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)帶型，說明乳品中蠟樣芽胞桿菌的污染來源廣泛，未發(fā)現(xiàn)分離基質(zhì)、分離時(shí)間與帶型之間的相關(guān)性。其中13個(gè)帶型包含菌株多于1株，其余93個(gè)帶型均只包含1株菌。相似性98%以上菌株大多為同一地區(qū)來源樣品中分離得到，其中包括64402、64403，62702、62712，66012、66013，63101、63103、63113，65102、65103、65111，62801、62802，65301、65303，003311、003323，21769、21772，003222、003224等菌株。

圖2 122 株蠟樣芽孢桿菌PFGE分子分型

3 討論

自蠟樣芽胞桿菌被報(bào)道可引起食物中毒以來，由其引起的感染事件呈逐年上升趨勢(shì)。近年來，蠟樣芽胞桿菌除可引起暴發(fā)性食物中毒外，還可引起胃腸外感染。蠟樣芽孢桿菌的致病性與其攜帶的毒力基因直接相關(guān)。食物中毒者產(chǎn)生的腹瀉癥狀主要由溶血型腸毒素基因hbl、非溶血型腸毒素基因nhe、細(xì)胞毒素基因cytK、腸毒素FM基因(entFM)和腸毒素T基因(bceT)所導(dǎo)致。溶血型腸毒素由亞基L1、L2及亞基B組成，分別由hblA、hblC、hblD三個(gè)基因控制合成；作用于細(xì)胞膜，并可與紅細(xì)胞結(jié)合，形成復(fù)合體，從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解。本研究中有67株蠟樣芽孢桿菌不攜帶hbl基因；55株蠟樣芽孢桿菌分別攜帶hblA、hblC、hblA-hblC、hblC-hblD或hblA-hblC-hblD。Hbl通過3個(gè)亞基依次與細(xì)胞膜進(jìn)行結(jié)合后才能破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞裂解。因此，包含hblA、hblC、hblD三個(gè)毒力基因并表達(dá)的蠟樣芽孢桿菌才能產(chǎn)生Hbl，本研究中有5株蠟樣芽孢桿菌同時(shí)具有這三種毒力基因。非溶血性腸毒素Nhe的三個(gè)亞基蛋白由nheA、nheB和nheC編碼；三個(gè)亞基蛋白中，NheB對(duì)Nhe的毒性起著關(guān)鍵性的作用，而NheC過量則會(huì)對(duì)Nhe的毒性起抑制作用，但三者同時(shí)存在并表達(dá)時(shí)毒性最大。本研究的122株蠟樣芽孢桿菌均檢測(cè)到nheB基因，99%的菌株同時(shí)攜帶nheA、nheB和nheC基因；且發(fā)現(xiàn)5株蠟樣芽孢桿菌同時(shí)攜帶nhe三個(gè)毒力基因和hbl三個(gè)毒力基因。除nhe和hbl基因外，所有菌株均攜帶entFM基因。有40株菌株攜帶bceT基因；有31株攜帶cytK基因。由此表明，nhe、entFM、hbl、bceT和cytK基因的檢出率偏高，是我國食源性蠟樣芽孢桿菌的主要毒力因子，與前人研究結(jié)果基本一致[24-26]。

遺傳、環(huán)境等因素會(huì)造成細(xì)菌變異，蠟樣芽胞桿菌也不例外。養(yǎng)殖過程長期使用抗生素會(huì)逐漸降低蠟樣芽胞桿菌對(duì)藥物的敏感性，使菌株產(chǎn)生耐藥性。因此，研究蠟樣芽胞桿菌菌株的耐藥性具有重要意義。細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性主要和靶基因突變及對(duì)外界的抗逆性有關(guān)，與產(chǎn)生毒素的毒力基因關(guān)系較小。目前，由于蠟樣芽孢桿菌對(duì)大部分β-酰胺類藥物均有耐性，因此對(duì)其感染的推薦用藥多為非β-酰胺類。本研究表明，分離得到的122株蠟樣芽胞桿菌對(duì)氯霉素、慶大霉素、阿米卡星的敏感性均達(dá)到100%；對(duì)紅霉素未出現(xiàn)耐藥菌株，但已有部分中介菌株。由此可見，氯霉素、慶大霉素、阿米卡星和紅霉素仍然可作為臨床治療推薦用藥，但應(yīng)警惕紅霉素耐藥蠟樣芽孢桿菌的出現(xiàn)。四環(huán)素類抗生素在乳制品中的最大殘留量為100 μg·kg-1[27]。常見致病菌多對(duì)四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生耐藥性，因此，目前四環(huán)素類抗生素僅用于支原體、衣原體、立克次體及軍團(tuán)菌的感染。本研究中約9%的菌株對(duì)四環(huán)素和復(fù)方新諾明表現(xiàn)出一定程度的耐藥性，與Fei等[28]研究結(jié)果相比，本研究分離的蠟樣芽孢桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性顯著提高。因此，在臨床用藥方面應(yīng)減少四環(huán)素的使用，且針對(duì)蠟樣芽孢桿菌感染的治療還應(yīng)盡量避免β-內(nèi)酰胺類抗生素、利福平及四環(huán)素類抗生素，可選用氯霉素類、氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素。