血清濃度對(duì)皮膚源性前體細(xì)胞在生物材料上增殖生長(zhǎng)的影響*

程 曉，王 澍，谷 苗，王 鈺，何江虹*

（南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心，南通 226001）

近年來,隨著組織工程生物材料的研究不斷深入,組織工程材料表面結(jié)構(gòu)形貌可以引導(dǎo)軸突和神經(jīng)細(xì)胞取向性生長(zhǎng),誘導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞定向分化,在神經(jīng)再生中具有重要影響。在干細(xì)胞的增殖和分化中,局部微環(huán)境起到關(guān)鍵性作用[1]。因此建立體外干細(xì)胞在生物材料上的培養(yǎng)生長(zhǎng)條件體系,對(duì)于研究干細(xì)胞在生物材料上的增殖、生長(zhǎng)、分化等十分重要。

皮膚源性前體細(xì)胞（skin-derived precursors，SKPs）是來源于胚胎期神經(jīng)嵴干細(xì)胞,具有高分裂增殖性、多分化潛能的皮膚源性神經(jīng)干細(xì)胞,易獲取,是一種理想的組織工程種子細(xì)胞,在神經(jīng)損傷修復(fù)微環(huán)境中可發(fā)揮多重效用[2-3]。本研究通過比較不同血清濃度培養(yǎng)條件下,SKPs 在蝶翅和殼聚糖膜等具有表面結(jié)構(gòu)形貌的生物材料上的增殖生長(zhǎng)情況,獲取SKPs在材料上培養(yǎng)的適宜血清條件,為進(jìn)一步研究SKPs在生物材料上的生長(zhǎng)分化奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生1 d SPF 級(jí)健康SD 大鼠,雌雄不限,由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 材料與試劑 大藍(lán)閃蝶（Morpho menelaus，W.m.）和天堂鳳蝶（Papilio ulysses telegonus，P.u.t.）蝶翅購自北京雨瀟傳媒公司；杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DWEW）/F12 培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、胰酶、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于Gibco 公司。細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購于R&D 公司。

1.3 生物材料的處理和制備 蝶翅材料的處理同文獻(xiàn)[4],大藍(lán)閃蝶（W.m.）和天堂鳳蝶（P.u.t.）蝶翅分別經(jīng)1 mol/L HCl 室溫浸泡2 h,2 mol/L NaOH 溶液45 ℃浸泡過夜處理后,水洗至中性。75%乙醇浸泡消毒過夜,使用前以紫外照射15～30 min 滅菌,DWEW 至少浸泡1 h。

參照文獻(xiàn)[4]制備5%殼聚糖膜,攪拌24～36 h 后加入水楊酸（salicylic acid，SA）,攪拌至無氣泡,滴在經(jīng)滅菌處理的24 孔板圓玻片上,覆蓋不同規(guī)格（10、30、50 μm）的橡膠印章,自然風(fēng)干后取下印章即制成不同規(guī)格的殼聚糖膜,以不覆蓋印章的殼聚糖平膜作為對(duì)照組。

1.4 大鼠SKPs 的體外分離培養(yǎng)與鑒定 參照J(rèn).BIERNASKIE 等[5-6]報(bào)道的方法,取新生1 d SD 大鼠背部皮膚約2 cm2,去除皮下組織,解剖液漂洗后剪碎,加入Ⅺ型膠原酶,37 ℃消化至組織呈云霧狀,加入清洗培養(yǎng)基終止消化；4 ℃1 200 r/min 離心5 min,棄上清,以清洗培養(yǎng)基重懸組織；用400 目篩網(wǎng)過濾,4 ℃下1 200 r/min 離心7 min 后棄上清,用含有40 ng/mL 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、20 ng/mL 表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、2%B27 和0.1%青霉素-鏈霉素混合溶液P/S 的無血清培養(yǎng)基重懸,以5.0×104個(gè)/mL 接種培養(yǎng)2 d 后更換培養(yǎng)皿,每3 d加入1～2 mL 含足量因子的培養(yǎng)基或半量換液,培養(yǎng)至8 d 時(shí),當(dāng)細(xì)胞球的中心部位因?yàn)闋I養(yǎng)不足開始發(fā)暗或細(xì)胞球開始貼壁時(shí)便可傳代。采用免疫熒光化學(xué)染色鑒定細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 SKPs 與生物材料共培養(yǎng) 將處理好的蝶翅和殼聚糖膜移入超凈臺(tái),75%乙醇浸泡過夜,雙蒸水漂洗材料,紫外光照消毒30 min,加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基室溫過夜。將純化傳代后的P3 代SKPs 用800 r/min 離心6 min 后棄上清,加入SKPs 種植培養(yǎng)基,混勻后培養(yǎng)于蝶翅和殼聚糖膜各組材料表面。倒置顯微鏡下對(duì)蝶翅和殼聚糖膜各組材料表面生長(zhǎng)的SKPs 觀察、拍照。

1.6 SKPs 在生物材料表面的細(xì)胞活力檢測(cè) SKPs在蝶翅和殼聚糖膜表面培養(yǎng)4、24 和48 h 后,在不同時(shí)間點(diǎn)將10 μL CCK-8 溶液與10 μL 培養(yǎng)基混勻后加入SKPs-材料中,放入培養(yǎng)箱孵育4 h 后,吸取不同SKPs-材料的上清液100 μL/孔分別加入96孔板中,每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,取出培養(yǎng)板,用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處吸光度。

2 結(jié) 果

2.1 不同血清濃度培養(yǎng)條件對(duì)SKPs 在蝶翅材料上增殖生長(zhǎng)的影響 從新生1 d 大鼠背部皮膚分離提取制備SKPs,培養(yǎng)24 h 后可見培養(yǎng)皿中有部分細(xì)胞貼壁,但大部分細(xì)胞為懸浮細(xì)胞。取上清換皿培養(yǎng)3 d 后可見細(xì)胞呈懸浮狀生長(zhǎng),大部分為小型細(xì)胞團(tuán),折光性強(qiáng),傳代后的P3 代SKPs 經(jīng)細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色檢測(cè),表達(dá)外胚層神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、中胚層間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin 和Fibronectin、毛囊真皮乳頭真皮鞘標(biāo)志物Versican,可與生物材料共培養(yǎng)。

將SKPs 在具有不同表面結(jié)構(gòu)形貌未包被促黏附試劑的兩種蝶翅材料上培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)SKPs 在兩種蝶翅材料表面均能黏附。CCK-8 法結(jié)果顯示,在含有1%FBS 培養(yǎng)基條件下,兩種蝶翅材料上培養(yǎng)4、24 h的SKPs 活力均顯著低于5%和10%FBS 培養(yǎng)基條件（P<0.05）,5%和10%條件下細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,但5%FBS 條件下細(xì)胞活力略高（圖1）。培養(yǎng)48 h 后倒置顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)1%FBS 培養(yǎng)基條件下,兩種蝶翅材料上均可見大量細(xì)胞碎片,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡,細(xì)胞趨于裂解死亡。而5%和10%FBS 培養(yǎng)條件下兩種蝶翅材料上細(xì)胞均折光性強(qiáng),輪廓清晰,可見明顯細(xì)胞突起,細(xì)胞生長(zhǎng)情況良好。同時(shí)可見5%和10%FBS 培養(yǎng)條件下在大藍(lán)閃蝶（W.m.）蝶翅表面細(xì)胞突起均基本沿嵴紋方向伸展,細(xì)胞排列具有顯著的方向性；在天堂鳳蝶（P.u.t.）蝶翅表面細(xì)胞突起生長(zhǎng)方向雜亂（圖2）。

圖1 SKPs 在蝶翅表面不同F(xiàn)BS 濃度條件下培養(yǎng)4、24 h 的細(xì)胞活力

圖2 SKPs 在蝶翅表面培養(yǎng)48 h 細(xì)胞形態(tài)觀察（Bar=20 μm）

2.2 不同血清濃度培養(yǎng)條件對(duì)SKPs 在殼聚糖膜材料上增殖生長(zhǎng)的影響 仿生大藍(lán)閃蝶蝶翅表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),制備表面具有平行嵴紋結(jié)構(gòu)的殼聚糖膜材料,且調(diào)整嵴紋結(jié)構(gòu)尺寸,制作10、30 和50 μm 3 種不同寬度,采用殼聚糖平膜為對(duì)照。通過光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察,條紋穩(wěn)定并且互相平行,殼聚糖平膜表面光滑平整,無雜質(zhì)。

將SKPs 在4 種具有不同表面結(jié)構(gòu)形貌的殼聚糖膜材料（10、30、50 μm、平膜）上培養(yǎng),材料上均不包被促黏附試劑,結(jié)果顯示SKPs 在材料表面均能黏附。在含有1%FBS 培養(yǎng)基條件下SKPs 的活力均顯著低于5%和10%FBS 培養(yǎng)基（圖3）。培養(yǎng)48 h 后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)1%FBS 培養(yǎng)基條件下,在4 種表面形貌殼聚糖膜上,細(xì)胞突起均回縮,細(xì)胞大多呈球形,細(xì)胞成團(tuán)現(xiàn)象增多,可見大量細(xì)胞碎片,胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡,細(xì)胞趨于死亡。而5%和10%FBS 培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長(zhǎng)情況良好,呈散在分布,折光性強(qiáng),輪廓清晰,出現(xiàn)較明顯的雙極或多極細(xì)胞突起,無明顯細(xì)胞碎片,尤其是表面具有10 μm嵴紋的殼聚糖模組,細(xì)胞數(shù)目較1%FBS 培養(yǎng)條件明顯增多,且細(xì)胞突起基本沿嵴紋方向伸展,細(xì)胞排列具有一定的方向性（圖4）。

圖3 SKPs 在殼聚糖膜表面不同F(xiàn)BS 濃度條件下培養(yǎng)4、24 和48 h 的細(xì)胞活力

圖4 SKPs 在具有不同表面結(jié)構(gòu)的殼聚糖膜表面培養(yǎng)48 h 細(xì)胞形態(tài)觀察（Bar=20 μm）

3 討 論

體外培養(yǎng)增殖是獲得足夠組織工程種子細(xì)胞的重要途徑。培養(yǎng)基中的血清可以提供細(xì)胞增殖生長(zhǎng)所需的因子,供給細(xì)胞培養(yǎng)體系中合成培養(yǎng)基所缺乏的營養(yǎng)成分,在細(xì)胞的增殖分化中發(fā)揮重要作用。但由于血清成分復(fù)雜,不同血清濃度可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7-8]。

根據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道,SKPs 增殖與分化通常采用高濃度FBS（10%～15%）培養(yǎng)基條件。也有研究[10]報(bào)道低血清濃度培養(yǎng)體系能使表皮干細(xì)胞存活、快速增殖,并能很好地維持表皮干細(xì)胞的特性。本研究為探討材料表面結(jié)構(gòu)對(duì)SKPs 增殖分化影響,降低培養(yǎng)基中血清含量,檢測(cè)低于常規(guī)血清濃度培養(yǎng)基條件下細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。

在使用經(jīng)酸堿處理過的天然蝶翅作為基質(zhì)材料培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),蝶翅材料上不需要包被促黏附試劑,SKPs 細(xì)胞在材料表面均能黏附。當(dāng)采用不同的血清濃度培養(yǎng)條件時(shí),發(fā)現(xiàn)在5%血清濃度條件下,細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)良好,與10%血清條件的細(xì)胞增殖率和生長(zhǎng)形態(tài)相似,甚至略好；但血清濃度降至1%時(shí),細(xì)胞增殖率顯著下降,與5%和10%的血清條件相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,細(xì)胞出現(xiàn)崩解死亡現(xiàn)象,表明過低的血清濃度培養(yǎng)條件可能不適宜細(xì)胞在生物材料上生長(zhǎng)。同時(shí)結(jié)果還顯示,相同血清濃度培養(yǎng)條件下細(xì)胞的增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在兩種不同表面形貌蝶翅材料上生長(zhǎng),但細(xì)胞的突起生長(zhǎng)方向差異明顯,與前期工作[4]中發(fā)現(xiàn)材料表面形貌對(duì)施萬細(xì)胞的影響相似,表明蝶翅材料表面結(jié)構(gòu)形貌可以調(diào)控多種細(xì)胞的定向運(yùn)動(dòng)遷移。

在仿生蝶翅表面結(jié)構(gòu)制備的殼聚糖膜材料上,采用不同的血清濃度條件培養(yǎng)SKPs,同樣可以發(fā)現(xiàn),較低血清濃度（5%）可以使細(xì)胞生長(zhǎng)良好,但血清濃度過低（1%）則細(xì)胞存活增殖生長(zhǎng)受損,與不同表面結(jié)構(gòu)的各種殼聚糖膜結(jié)果相似。

總之,本研究結(jié)果表明SKPs 在具有表面形貌的生物材料表面的增殖生長(zhǎng)需要一定濃度的血清條件,為進(jìn)一步探討SKPs 在具有表面形貌的生物材料表面的分化所需微環(huán)境等研究提供了實(shí)驗(yàn)參考。