基因編輯技術(shù)及CRISPR/Cas系統(tǒng)在草地植物開發(fā)中的應用

朱麗珍 王芳 王婭麗 何軍 李彥龍 田英

摘要：隨著高通量測序技術(shù)的興起，功能基因組學研究得以迅猛發(fā)展?；蚪M定點修飾技術(shù)作為一項研究特定基因功能的工具，對功能基因組學的研究具有極強的推動作用。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種適應性免疫防御系統(tǒng)，在細菌、古細菌的長期演化過程中形成，用于對抗入侵的病毒及外源DNA。通過對各種基因編輯技術(shù)的對比，發(fā)現(xiàn)相比于DNA同源重組、鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）等技術(shù)，基于RNA指導的CRISPR/Cas系統(tǒng)為基因組定點編輯開辟了一條新的道路，在基因功能研究中具有效率高、成本低、易于操作等顯著優(yōu)點。從作用機制和發(fā)展歷程等方面對目前基因編輯的4種技術(shù)進行簡述，進一步總結(jié)CRISPR/Cas系統(tǒng)在經(jīng)濟林木、作物、植物病毒和牧草植物功能基因組編輯中的研究應用，以期為促進基因編輯技術(shù)在農(nóng)牧生產(chǎn)中的應用提供參考。

關(guān)鍵詞：基因編輯;CRISPR/Cas系統(tǒng);草地植物開發(fā);生產(chǎn)應用;功能基因組

中圖分類號：S188; Q78? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）20-0022-08

收稿日期：2021-02-01

基金項目：寧夏自然科學基金（編號：2018AAC03223）;寧夏高等學校科學研究項目（編號：NGY2018008）;寧夏農(nóng)林科學院農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展和生態(tài)保護科技創(chuàng)新示范課題（編號：NGSB-2021-2-01）。

作者簡介：朱麗珍（1990—），女，山東菏澤人，博士研究生，助理研究員，主要從事植物資源開發(fā)利用研究。E-mail：lizhenzhu916@163.com。

通信作者：田 英，博士，副研究員，主要從事逆境植物資源開發(fā)利用研究。E-mail：tianying_1982@126.com。

結(jié)構(gòu)基因組學和功能基因組學是基因組學的兩大主要研究內(nèi)容，其中結(jié)構(gòu)基因組學研究旨在揭示基因的結(jié)構(gòu)、序列信息及基因的定位和編輯機制等;功能基因組的研究旨在揭示基因的功能和進化原理。近年來，動植物物種全基因組測序飛速發(fā)展，測序結(jié)果陸續(xù)公布，大大推動了各組學的研究進展，功能基因組研究成為了研究的主流。基因組定點修飾技術(shù)是在基因組的精確位點上進行靶向修飾改造的技術(shù)，是目前研究基因功能的有利工具，對改造和驗證特定基因的功能具有重要意義。

基因組編輯（genome editing，GE）作為基因組定點修飾技術(shù)，是當前生命科學研究的前沿領(lǐng)域[1]。目前，基因組編輯方法主要包括DNA同源重組技術(shù)、鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）技術(shù)以及CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins） 技術(shù)等，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)最便捷、高效，應用也最廣泛[2]。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)已應用于人類遺傳病治療[3]、細胞個性化治療[4]、新藥開發(fā)[5]及作物遺傳改良[6]等領(lǐng)域。這些基因編輯技術(shù)的使用，使得生物體基因組DNA的靶向修飾成為可能。

1 基因編輯技術(shù)

1.1 DNA同源重組技術(shù)

DNA雙鏈之間可發(fā)生核酸信息的交換和重組，根據(jù)這一原理可以進行基因組的靶向修飾，亦稱為同源重組。該技術(shù)的具體操作方法是通過將人為改造后獲得的重組DNA通過同源重組技術(shù)轉(zhuǎn)入受體細胞核內(nèi)，經(jīng)過同源重組作用，受體細胞內(nèi)原始的基因序列被重組的DNA序列替換，最終達到敲除受體細胞內(nèi)靶基因序列的目的。

DNA同源重組技術(shù)是基因編輯初期的基因組靶向修飾技術(shù)，雖然該技術(shù)能導致目的基因失活，但是難以突破遠緣雜交不親和的障礙，不能產(chǎn)生新的基因，因此應用范圍較為狹窄。Kim等研究發(fā)現(xiàn)，在高等植物和動物細胞中，外源DNA導入受體細胞后與靶標DNA序列同源重組的概率十分低，僅為0.9%左右，過低的靶向修飾效率大大影響了DNA同源重組技術(shù)的發(fā)展[7]。

1.2 ZFNs技術(shù)

ZFNs技術(shù)，即鋅指核酸酶技術(shù)，是通過人工合成核酸內(nèi)切酶，進而對目的基因進行定點修飾的技術(shù)[8]。ZFNs技術(shù)在DNA水平上進行靶基因的定向修飾，修飾效率可以達到10%及以上，并且可以穩(wěn)定遺傳給后代[9]。隨著鋅指核酸酶技術(shù)的開發(fā)，ZFNs技術(shù)被廣泛應用于多種動植物中，Sander等利用CoDA（使用標準克隆技術(shù)或自定義DNA合成來設(shè)計ZFNs）ZFNs技術(shù)，快速改變了斑馬魚、擬南芥和大豆的20個基因[10]，CoDA的簡單和有效使用，促使ZFNs技術(shù)的廣泛應用成為可能，并為該技術(shù)運用到多基因通路或全基因組改變等方向成為可能。此外，ZFNs技術(shù)還被應用到人體培養(yǎng)細胞上，并從基因上改變了CD4+T細胞對HIV-1的抗性[11]。此外，該技術(shù)還被應用到小鼠、果蠅[12]及黑麥草[13]、水稻[14]等的研究中。

然而，ZFNs技術(shù)在基因操作的過程中，由于隨機插入外源基因，容易出現(xiàn)突變和不易調(diào)控等，并且脫靶效應較為嚴重，因此缺乏DNA靶定特異性[15]，而這種DNA的靶定非特異性，易引發(fā)細胞毒性效應[16]，對受體細胞的活性產(chǎn)生不利影響。

1.3 TALENs技術(shù)

TALENs技術(shù)是一種新型的基因定點修飾技術(shù)，是基于TALE核酸酶的一種嶄新的分子生物學工具[17]，被稱為2012年度十大科學突破之一。Cermak等對TALENs技術(shù)進行研究發(fā)現(xiàn)，它主要由TALE蛋白和FokⅠ核酸內(nèi)切酶2個元件組成，并且2個元件分工不同，隨后將TALE蛋白與Fok Ⅰ核酸內(nèi)切酶融合，發(fā)現(xiàn)TALE蛋白在此過程中負責特異性結(jié)合DNA序列，F(xiàn)okⅠ核酸內(nèi)切酶負責在受體細胞內(nèi)發(fā)揮剪切作用[18]。TALE特異性結(jié)合DNA的模式是一種特殊編碼模式，可根據(jù)需求對任意靶基因的DNA序列進行人工設(shè)計，進而合成相應的TALE蛋白，無基因序列、細胞、物種的限制[18-19]。

自TALE序列被完全破譯后，TALENs技術(shù)開始得到普及。TALENs的特異性切割活性在酵母[20]、擬南芥[21-22]、水稻[23]及斑馬魚[10]等多個動植物體系和體外培養(yǎng)細胞中得以驗證。2014年魏文盛所在課題組依托一種自主研發(fā)的TALE蛋白組裝技術(shù)完成了全部TALE元件的解碼工作[24]。自2011年TALENs技術(shù)被首次成功運用于基因定點修飾[25]以來，發(fā)展十分迅速并在全球范圍內(nèi)廣泛應用[26]。

與ZFNs相比，TALENs結(jié)合DNA的方式更便于預測和設(shè)計靶向基因序列，TALE蛋白的組裝和構(gòu)建有助于實現(xiàn)大規(guī)模和高通量的組裝;此外，TALENs的特異性比ZFNs高，且毒性和脫靶性相對較低[27]。因此可以看出，TALENs技術(shù)是基因定點修飾發(fā)展史上又一新的里程碑，它特異性高、定點突變、穩(wěn)定遺傳等技術(shù)特點，促使它被廣泛應用于各種動植物的基因定點修飾中。但是，在TALENs技術(shù)的應用中也暴露了很多缺點，例如導致細胞毒性、模塊組裝過于繁瑣、測序工作量大，并且一般只能由大型的測序公司完成，成本和代價較高等，大大限制了TALENs技術(shù)的完善和發(fā)展[28]。

1.4 CRISPR/Cas技術(shù)

CRISPR指廣泛存在于細菌和古細菌基因組中的成簇且具有規(guī)律間隔的短回文重復序列，與防御機制相關(guān);Cas能夠以一種序列依賴性的方式對DNA進行靶向切割作用，是一種與CRISPR系統(tǒng)關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)和基因家族的簡稱[29]。CRISPR/Cas原理見圖1。CRISPR/Cas9是一種新型基因編輯系統(tǒng)，但其作用與基因定點修飾的機制與RNA干擾（RNAi）過程相似，利用小CRISPR RNA（crRNA）分子與目標基因的特定DNA區(qū)段發(fā)生結(jié)合，再由相關(guān)內(nèi)切酶Cas蛋白進行特異性切割，可以引發(fā)基因組的定點突變[30-31]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)有助于細菌對抗病毒、對付攻擊者，從而保護自身[32]。研究者發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9作為一種萬能基因編輯器，可用來激活、抑制、刪除或者添加異體生物的目標基因[33]。早在1987年，日本的研究人員在調(diào)查細菌的一種編碼堿性磷酸酶的基因序列時便發(fā)現(xiàn)了1段短重復的核苷酸序列，位于鄰近DNA片段中間，且兩側(cè)為短特異片段，但是關(guān)于這些重復序列的生物學意義并不清楚[34]。2000年，短重復的核苷酸序列被命名為短間隔重復序列[35];2002年SRSR被重命名為CRISPR[36]。2013年2月，《Science》雜志上發(fā)表的2篇文章表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能有效地靶向酶切293T、K562等多種細胞，且非同源末端連接同源重組效率為3%～25%，可用于動植物及人等基因組的編輯，從而開啟了植物新型基因編輯的新紀元[37-38]。目前，在植物中，CRISPR/Cas9已對超過30種植物物種和數(shù)百個基因?qū)崿F(xiàn)成功編輯，并且在農(nóng)作物抗逆性及抗病蟲害研究中的應用廣泛[39-40]，在主要糧食作物中，改變并創(chuàng)造出了眾多有益性狀，可見CRISPR/Cas9技術(shù)作為一種可以在植物上廣泛使用的生物技術(shù)而被迅速推廣[41]。

2 CRISPR/Cas技術(shù)的優(yōu)越性

根據(jù)基因編輯現(xiàn)有研究結(jié)果[7，26，42]，分別對ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas技術(shù)在靶點結(jié)合域、載體設(shè)計及構(gòu)建難易程度、靶位點要求、細胞毒性、脫靶率、載體構(gòu)建所需要時間和成本進行對比，詳見表1。

通過對4種基因定點修飾技術(shù)的理解以及3種基因編輯的綜合分析發(fā)現(xiàn)，DNA同源重組技術(shù)存在特異性低、修飾效率低、不可穩(wěn)定遺傳等較為突出的技術(shù)弊端。相比之下，ZFNs技術(shù)、TALENs技術(shù)以及CRISPR/Cas技術(shù)的發(fā)展前景則更為樂觀[43]。但在基因組定點修飾方面，TALENs和ZFNs技術(shù)在實際操作過程中的技術(shù)難度較大、構(gòu)建載體時間較長，不能在常規(guī)實驗室得到高效利用，而CRISPR/Cas技術(shù)相對操作簡單，制作成本低，可以在普通的分子生物學實驗室進行廣泛應用[44]。CRISPR/Cas技術(shù)能同時作用于多個靶位點[6]，并能精準完成對緊隨其后的NGG （PAM序列） 20 bp序列的編輯[45]。此外，載體構(gòu)建方面，ZFNs和TALENs技術(shù)對各基因位點進行編輯時都須設(shè)計和組裝2個核酸酶，操作復雜且成功率低，而CRISPR/Cas系統(tǒng)中由于Cas9基因相同，只需對特定基因位點設(shè)計sRNA即可。因此可見，CRISPR/Cas系統(tǒng)更容易得到推廣和應用[43]。

3 CRISPR/Cas技術(shù)在草地植物領(lǐng)域中的應用

CRISPR/Cas基因組編輯系統(tǒng)由Cas核酸酶蛋白和向?qū)NA 2個部分組成，其中向?qū)NA能夠與基因組目標位點DNA序列互補配對，并引導Cas核酸酶蛋白對該互補序列進行定向剪切。作為一種簡單有效的基因組編輯工具，CRISPR已在多種重要作物中實現(xiàn)了基因定點敲除、等位基因單堿基替換和外源DNA片段定點整合。目前該技術(shù)已被成功應用到擬南芥[46]、水稻[47]、小麥[48]、煙草[49]、番茄[50]、大豆[51]、地錢[52]、甜橙[53]、苜蓿[54]等基因組中單個位點及少數(shù)多個位點的修飾中。說明CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)能擺脫無干細胞系的限制，可在任何植物中實現(xiàn)定向、精準的基因修飾。

由于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1（Cas12a）等核酸酶可以針對特定基因組DNA序列實現(xiàn)可編程定向剪切[55]，并能以前所未有的精準度和便捷度進行基因組編輯，因此被廣泛應用于動、植物及微生物的基因功能解析、新種質(zhì)創(chuàng)制、基因治療等基礎(chǔ)研究及應用實踐工作中，被認為是21世紀生物技術(shù)領(lǐng)域的重大突破[56]。CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種全新的基因編輯技術(shù)，除了在動物育種和疾病治療中發(fā)揮了優(yōu)勢外，在植物基因功能的研究中也體現(xiàn)出其簡便、高效的特點。CRISPR/Cas系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)以后，很快就被應用到了高等植物基因功能的研究中。此外，該技術(shù)還被成功用于對多種植物內(nèi)源基因的編輯[57]，CRISPR/Cas9技術(shù)迅速成為植物研究的一種熱門手段。

3.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在木本植物功能基因組中的應用

目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在木本植物中實現(xiàn)了基因組的編輯和靶位點的突變。佛羅里達大學柑橘研究團隊首次采用CRISPR/LbCas12a（LbCpf1）對柑橘屬中的西柚基因組進行了編輯，獲得了可以定向修飾目的基因的轉(zhuǎn)基因西柚，在有效緩解病原菌感染的同時，沒有觀察到潛在的脫靶效應[58]。此外，研究者在合成sgRNA靶向基因后，通過農(nóng)桿菌的介導，向甜橙中導入Cas9及該靶向基因，最終獲得目標位點靶向基因的突變。此外，有效利用RNA/sgRNA系統(tǒng)及啟動子系統(tǒng)等已經(jīng)在木本植物中實現(xiàn)了基因組序列的精準編輯和突變體基因的有效敲除。Liu等通過將CRISPR/cas9和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計引導RNA靶定基因的不同基因組位點，建立了高效的楊樹多基因靶向誘變技術(shù)，最終在轉(zhuǎn)基因楊樹中獲得了明顯的白化突變表型[59]。

3.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)在作物遺傳改良中的應用

作物改良對于產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性的提高至關(guān)重要，而遺傳多樣性是其改良的關(guān)鍵。CRISPR/Cas作為快速高效的遺傳操作工具，在作物遺傳改良方面亦表現(xiàn)出巨大的應用潛力。近年來，基因編輯在棉花上的應用也成為了研究的熱點，其中華中農(nóng)業(yè)大學金雙俠教授團隊2019年在《Plant Biotechnology Journal》上發(fā)表的2篇棉花基因編輯的文章就是其中的典型代表，該研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了適用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化的堿基編輯系統(tǒng)，在全基因組水平預測了1 500個潛在脫靶位點后未發(fā)現(xiàn)脫靶效應，進一步證實單堿基編輯系統(tǒng)對棉花基因組編輯具有較強的特異性[60]。金雙俠教授團隊的另一研究以棉花內(nèi)源葉綠體形成相關(guān)基因（GhCLA）為靶標，通過tRNA-sgRNA轉(zhuǎn)錄單元構(gòu)建了基因編輯載體，對轉(zhuǎn)化獲得的目標位點進行檢測，發(fā)現(xiàn)其突變率達到87%;進一步對最具潛力的6個脫靶位點進行檢測后，并未發(fā)現(xiàn)脫靶效應，這為四倍體棉花建立高效的CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)提供了良好的選擇[61]。韓國的一個研究課題組利用雙生病毒多復制子的特點優(yōu)化了Cpf1介導的CRISPR系統(tǒng)，創(chuàng)建了依賴于CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的同源重組插入外源DNA片段的載體表達系統(tǒng)，通過同源重組策略高效地在番茄中實現(xiàn)了基因編輯過程，為作物改良提供了更好的研究手段[62]。

福建農(nóng)林大學關(guān)躍峰團隊在前期高通量創(chuàng)制大豆多基因突變技術(shù)體系的基礎(chǔ)上[63]，利用CRISPR/Cas技術(shù)成功地篩選出脂氧合酶 （LOX）失活株系，從根源上解決了大豆的豆腥味問題，該技術(shù)的應用可快速在主推大豆品種中疊加無豆腥性狀，提升加工和營養(yǎng)品質(zhì)，在一定程度上避免了基因聚合及親本對品種選育時間的限制[51]，因此不影響其他主要農(nóng)藝性狀。在農(nóng)藝性狀改良過程中，一種不需要轉(zhuǎn)基因的基因組編輯技術(shù)目前也得到了成功應用，該研究以小麥愈傷組織細胞為研究對象，瞬時表達CRISPR/Cas9的DNA或RNA，可獲得純合的小麥突變體再生植株，并且無任何轉(zhuǎn)基因成分[64]，該技術(shù)的應用大大推進了小麥品質(zhì)改良或者其他轉(zhuǎn)化困難植物的研究進程。

3.3 CRISPR/Cas9技術(shù)在草地植物抗病毒中的研究應用

近年來，以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為首的基因組編輯技術(shù)在植物與病毒互作的基因組研究中也得到了進一步的開發(fā)與完善?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠抑制植物DNA病毒的擴展和蔓延[65]。Liu等通過在花椰菜中表達Cas9/sgRNA，發(fā)現(xiàn)Cas9能夠刪減或者突變花椰菜花葉病毒（CaMV） 基因關(guān)鍵功能區(qū)的核苷酸序列，進而抑制CaMV感染[66];而小干擾RNA（siRNAs）抑制CaMV感染的原因并未得到證實，說明CRISPR/Cas9技術(shù)對 CaMV具有強大的抗病毒特性。另一項研究表明，CRISPR/Cas9技術(shù)對菜豆黃矮病毒（單鏈DNA病毒）的抑制作用同樣有效[67]，進一步證實CRISPR/Cas9系統(tǒng)對植物DNA病毒的抑制作用具有普遍適用性。

3.4 CRISPR/Cas技術(shù)在草類植物中的研究應用

CRISPR/Cas9技術(shù)在草類植物功能基因組學中的研究與柑橘、甜橙等經(jīng)濟林木和水稻、小麥等主要糧食作物相比嚴重滯后且處于起步階段，而高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展大大推動了牧草植物基因組學研究。二穗短柄草（Brachypodium distachyon）是草類禾本科植物功能基因組學研究的模式植物，CRISPR/Cas9技術(shù)在其基因編輯方面已經(jīng)獲得成功應用。例如，李奇等通過對Bd ID1 （B. distachyon ID轉(zhuǎn)錄因子）基因不同外顯子分別設(shè)計敲除位點，運用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除目的基因Bd ID1，對獲得的轉(zhuǎn)基因后代進行基因型鑒定，獲得導致Bd ID1功能完全缺失的株系，進一步驗證ID1是禾本科特有的基因，與調(diào)控開花時間通路相關(guān)[68-69]。此外，劉瑤瑤利用CRISPR/Cas9技術(shù)分別敲除了二穗短柄草的BdVRN1和BdFUL2基因，完成了2個轉(zhuǎn)錄因子亞家族基因的編輯，并成功獲得單堿基插入/缺失的突變體植株，為基因功能的進一步研究提供了基礎(chǔ)材料[70]。CRISPR/Cas9技術(shù)在二穗短柄草基因功能研究中的應用，將為其他禾本科植物的遺傳改良和育種提供參考和理論基礎(chǔ)[71]。

目前，CRISPR/Cas9技術(shù)在草類植物中的研究逐步展開，其中包括1種重要的牧草資源——蒙古冰草，它不僅是一種重要的資源植物，還具有極高的飼用價值、遺傳價值和生態(tài)價值[72]。此外，蒙古冰草蘊含大量抗性基因，對禾本科牧草或作物的抗逆性研究有重大潛力[73]。但是，相對于經(jīng)濟林木和作物研究，蒙古冰草功能基因的挖掘工作開展得較晚，尤其是基因編輯及CRISPR/Cas9技術(shù)在牧草方面的應用發(fā)展得較為緩慢。關(guān)于此方面的研究，目前僅有張文靜等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對蒙古冰草原生質(zhì)體基因組進行編輯，建立了高效的蒙古冰草CRISPR/Cas9靶位點篩選系統(tǒng)，從而最終在原生質(zhì)體基礎(chǔ)上首次建立了高效蒙古冰草瞬時轉(zhuǎn)化體系的報導[74]。對蒙古冰草功能基因的挖掘及分子育種帶來革命性的影響，為后續(xù)快速構(gòu)建蒙古冰草穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化植株奠定了基礎(chǔ)。

燕麥作為生長在溫帶冷涼地區(qū)主要的糧飼兼用作物，不但莖葉多汁、適口性好[75]，而且蛋白質(zhì)、脂肪、可消化纖維的含量都比較高，是理想的糧食和飼料作物[76]。但是燕麥育種發(fā)展緩慢，尤其以基因編輯為主要手段的分子育種較少，與其他作物相比明顯滯后。武志娟首次在燕麥育種中利用 CRISPR/Cas9技術(shù)進行基因編輯，構(gòu)建抗拿捕凈除草劑表達載體后，利用基因槍法建立了高效的燕麥 CRISPR/Cas9基因編輯的最佳靶標位點篩選體系，最終獲得2株Cas9編輯所產(chǎn)生的突變植株[77]，從而為基因編輯技術(shù)在草類植物分子育種中的應用提供了試驗依據(jù)。

此外，紫花苜蓿作為世界上最重要的草地作物，被稱為“牧草之王”。近年來，激增的家畜養(yǎng)殖對優(yōu)質(zhì)牧草，特別是紫花苜蓿的需求量極大增加，而國內(nèi)尚缺乏自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿品種資源，優(yōu)質(zhì)苜蓿種子大量依靠進口。而且，由于紫花苜蓿具有同源四倍體和異花授粉特性，一直以來極大阻礙了其基因密碼的破譯和新品種培育。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在紫花苜蓿中亦得到了有效應用。例如，Gao等應用Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)對紫花苜蓿SPL9基因進行編輯，并采用微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）進行亞克隆和測序，最終成功應用CRISPR/Cas9技術(shù)對紫花苜蓿的四倍體基因組進行編輯，為紫花苜蓿育種提供了技術(shù)支持[78]，但在如何提高基因編輯效率方面還需要進一步探索。近日，研究者首次完成了同源四倍體紫花苜?；蚪M的破譯并建立了基于CRISPR/Cas9技術(shù)的高效基因編輯育種體系，成功獲得一批多葉性狀穩(wěn)定且不含轉(zhuǎn)基因標記的紫花苜蓿新材料[79]。此外，研究者利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對控制花期調(diào)控基因進行定點敲除并結(jié)合雜交手段，成功創(chuàng)制出適宜低緯度地區(qū)種植的大豆材料，為豆科植物品種改良提供了新的基礎(chǔ)材料[80]。

通過分析草地植物的研究現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為新型的植物基因編輯技術(shù)，關(guān)于其功能基因組的研究仍存在很大的研究空間及研究價值，尤其是近年來CRISPR/Cas9技術(shù)對牧草品種的改良具有巨大潛力和廣泛的應用前景。

4 CRISPR/Cas技術(shù)在牧草植物中的應用前景及展望

牧草植物作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，由于人類長期過度放牧和開墾等不合理利用造成草地退化、植被密度減小、蓋度下降等，致使草地生態(tài)系統(tǒng)服務功能減弱、功能價值減少。隨著高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多植物的全基因組序列被公布出來，但是針對牧草植物的測序工作少之又少，并且關(guān)于基因功能研究、遺傳改良、分子育種等研究的技術(shù)手段有限，種種因素都極大地限制了牧草植物分子育種的發(fā)展及功能基因組學的研究。然而，近年來已有大量研究者提出了各種有效的草地生態(tài)恢復手段，其中以CRISPR/Cas9技術(shù)為首的基因編輯技術(shù)在草地植被恢復過程中的應用是一個不容小覷的因素，該技術(shù)的應用能夠因地制宜地挖掘鄉(xiāng)土品種與抗逆性、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等相關(guān)的基因，并能在極大縮短育種年限的情況下，實現(xiàn)對優(yōu)良草地植物的收集、開發(fā)、利用及草地生態(tài)功能的修復。

4.1 縮短牧草育種年限、精準育種，提高牧草產(chǎn)量

基因組編輯技術(shù)可以通過定向修飾植物基因組，進而推動植物育種進程，在實現(xiàn)牧草植物精準育種方面具有極大的開發(fā)潛力。然而，牧草許多重要農(nóng)藝性狀是由單個或少數(shù)核苷酸的改變或突變引起的，具有很多不確定性。牧草植物基因編輯困難重重，主要表現(xiàn)在同源重組在牧草植物中的效率極低，通過基因編輯的方式獲得高效、穩(wěn)定的基因組的精準性較差;獲得理想的轉(zhuǎn)基因植株費時且費力，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)只能將外源基因隨機整合到植物基因組中，插入位點的隨機可導致內(nèi)源基因破壞和外源基因沉默等不利結(jié)果。與自然進化和傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因手段相比，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因組編輯可利用外源修復模板通過同源重組介導的修復方式實現(xiàn)目標基因核苷酸的改變，因此，通過對控制牧草關(guān)鍵性狀基因的編輯，可加快良種選育的進度。此外，在牧草功能基因研究領(lǐng)域，CRISPR/Cas技術(shù)的應用對實現(xiàn)定向育種，培育高產(chǎn)、抗逆等適應性強、生態(tài)價值高價的牧草植物具有重大潛力。例如，Chen等開發(fā)的基于CRISPR/Cas9的高效基因編輯技術(shù)體系，不僅成功培育了一批多葉型紫花苜蓿新材料，而且重要的是該編輯技術(shù)的應用無需導入外源基因和轉(zhuǎn)基因過程，僅需獲得自身的突變體即可，該技術(shù)的應用將大大加快傳統(tǒng)育種的速度[79]。

4.2 挖掘牧草營養(yǎng)品質(zhì)的代謝通路，改良牧草品質(zhì)

目前，對牧草研究關(guān)注的重點大多是種植管理、適口性及營養(yǎng)品質(zhì)分析等方面，對相關(guān)基因的研究，尤其是一些營養(yǎng)品質(zhì)代謝通路上基因細節(jié)方面，如啟動子、增強子、抑制子的研究并不深入;此外，絕大多數(shù)牧草的遺傳轉(zhuǎn)化體系還不完善，由于難以建立起有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系而無法開展轉(zhuǎn)基因研究。一系列生物技術(shù)應用的局限性限制了CRISPR/Cas系統(tǒng)在牧草植物功能基因研究中的應用。

吳香瑩等研究了CRISPR/dCas9 系統(tǒng)對苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）320內(nèi)源hemE基因的作用，可有效促進代謝流向維生素B12合成方向轉(zhuǎn)移，不但豐富了可用于分析苜蓿中華根瘤菌的工具庫，也為苜蓿遺傳和營養(yǎng)品質(zhì)代謝研究提供了新思路[81]。此外，苜蓿中木質(zhì)素含量高是飼料消化率低的限制因素之一。傳統(tǒng)方法可通過嘗試減少木質(zhì)素的含量來提高苜蓿飼料的消化率，但效果均不顯著。而CRISPR/Cas9技術(shù)則可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)這一目標。Meng等優(yōu)化并開發(fā)一種農(nóng)桿菌介導的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功誘導紫花苜蓿靶向基因組的修飾，并利用該系統(tǒng)，獲得了T0代內(nèi)源基因MtPDS的單等位基因和雙等位基因純合子突變體，進一步證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以作為研究基因功能的有效工具[54]，為CRISPR/Cas9技術(shù)在減少木質(zhì)素的含量、提高苜蓿飼料的消化率方向的應用提供了參考價值。此外，Cai等利用改造后的CRISPR基因組編輯系統(tǒng)，率先實現(xiàn)了豆科植物基因的單堿基替換，并獲得了表型穩(wěn)定的純合突變系[82]，為豆科植物重要農(nóng)藝性狀的定向改良提供了新技術(shù)、新路徑。

4.3 提高牧草植物對除草劑的抗性

牧草植物在大面積推廣種植過程中雜草危害嚴重，而人工除草成本很高，利用除草劑對不同植物類型進行選擇性防除，并開發(fā)出專用型除草劑在很多大田作物上得到了實現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）基因是禾本科植物抗拿捕凈除草劑的關(guān)鍵基因，除草劑的抗性變化與異亮氨酸能否突變?yōu)榱涟彼嵯嚓P(guān)。因此，研究者可以通過構(gòu)建乙酰輔酶A羧化酶基因的CRISPR/Cas9表達載體，通過編輯禾本科牧草的ACCase基因，找到氨基酸突變關(guān)鍵位點序列，進而促使禾本科牧草對除草劑產(chǎn)生抗性。該方法已經(jīng)在燕麥上得到了實現(xiàn)，研究者通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)完成了對燕麥轉(zhuǎn)基因植株中ACCase基因的成功敲除，盡管沒有完成靶向敲除，但也為后續(xù)通過禾本科牧草基因組編輯產(chǎn)生抗除草劑特性試驗提供理論依據(jù)[83]。

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