代償期乙型肝炎肝硬化濕熱證患者腸道菌群特征分析*

胡萌，翟昌明，張冬，卓永祥，李丹，田廣俊

廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院，廣東 珠海 519015

肝硬化是各種慢性肝病的重要階段，其中乙型肝炎肝硬化是我國當前最主要的肝硬化疾病，是導致肝癌、肝移植等終末期肝病的重要危險因素[1]。腸道菌群是由細菌、真菌、原生動物、古細菌等組成的多樣化生態(tài)系統(tǒng)，它們相互共生并寄生于人體，對維持機體正常生理狀態(tài)起到重要作用[2]。眾多研究表明，腸道菌群與肝臟通過腸-肝軸相互聯(lián)系，乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群發(fā)生變化，其菌群種類、比例與肝臟免疫及炎癥息息相關[3-4]。

濕熱首見于《素問·生氣通天論》，后世醫(yī)家對濕熱的病因病機及治法進行了完善和豐富。濕熱二邪相互裹挾，重滯黏膩，病勢纏綿難解，濕熱證候在我國嶺南地區(qū)較常見，多與肝、膽、脾、胃、三焦關系密切[5]。雖然腸道菌群與肝硬化進展密切相關，但目前關于代償期乙型肝炎肝硬化濕熱證患者與其他證候患者糞便微生物群比較研究的報道較少。本研究初步分析了乙型肝炎肝硬化不同中醫(yī)證候腸道菌群的變化特征，以期進一步揭示肝硬化濕熱證的生物學基礎及與腸道菌群的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年1—12月廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院肝病科門診和住院收治的代償期乙型肝炎肝硬化濕熱證患者33例、非濕熱證患者49例及對照組24例為研究對象。濕熱證組男20例，女13例；年齡(43.40±7.26)歲。非濕熱證組男30例，女19例；年齡(41.55±8.86)歲。對照組男15例，女9例；年齡(40.52±7.84)歲。3組患者基線資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。研究符合醫(yī)學倫理要求并通過廣東省中醫(yī)院倫理委員會審核批準(BF2019-078-01)，所有入選者均對研究知情同意。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 符合《慢性乙型肝炎防治指南》[6]和《肝硬化診治指南》[7]的診斷標準。

1.2.2 中醫(yī)診斷標準 符合《中藥新藥臨床研究指導原則》[8]和《肝硬化中西醫(yī)結合診療共識》[9]的診斷標準。主癥：①口干苦或口臭；②脅脹或痛；③大便黏滯穢臭或大便不爽。次癥：①納呆；②胃脘脹悶；③倦怠乏力；④皮膚鞏膜黃染。舌脈：舌質紅、苔黃膩、脈弦數或弦滑數。證型確定：具備主癥2項和次證1或2項，參考舌脈象。

1.3 病例納入標準年齡30～50歲；符合乙型肝炎肝硬化的中醫(yī)、西醫(yī)診斷標準；近1個月內未使用過抗生素、微生態(tài)調節(jié)劑等影響腸道微生態(tài)的藥物；簽署研究知情同意書。

1.4 病例排除標準近1個月內有使用過抗生素、微生態(tài)調節(jié)劑等影響腸道微生態(tài)的藥物；近1個月內全身有除乙肝病毒之外的其他病毒、細菌、真菌感染；近1個月內有腹瀉等腸道疾病的發(fā)生；合并炎癥性腸病、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病者；飲食習慣特殊者，例如素食者；合并甲型、丙型、丁型、戊型等類型肝炎及其他嗜肝病毒感染；合并自身免疫性肝病、血吸蟲性肝病、肝豆狀核變性等其他慢性肝?。婚L期服用明確肝毒性藥物或酒精攝入量每周>140 g；合并心、肺、腎、血液系統(tǒng)及胃腸道嚴重原發(fā)病或精神??；患者或患者家屬不同意接受研究隨訪。

1.5 病例剔除標準凡在入組后發(fā)現不符合試驗方案者；入組后發(fā)現嚴重疾病者。

1.6 研究方法

1.6.1 16S rDNA測序方法 參照文獻[10]方法進行測序：收集研究對象檢查當日晨起的大便，凍存于-80 ℃ 冰箱，待樣品收集完成后，低溫(0 ℃)運送至上海中科新生命生物科技有限公司進行糞便DNA的提取及16Sr DNA檢測。采用CTAB或SDS方法對樣本的基因組DNA進行提取，并對DNA的純度和濃度進行檢測。根據測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物和高保真DNA聚合酶對選定的V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行切膠回收，膠回收采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)。參照電泳初步定量結果，對PCR擴增回收產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行檢測定量，按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。使用NEBNext?UltraTMDNALibraryPrepKit建庫試劑盒進行文庫構建。構建好的文庫通過AgilentBioanalyzer2100和Qubit進行質檢，文庫質檢合格后采用IlluminaMiseq測序平臺對V3-V4可變區(qū)進行擴增和測序。

1.6.2 腸道菌群測序結果分析 參照文獻[11]，根據得到的原始測序數據對低質量測序數據進行過濾后，進行組裝和再過濾，進行OTU聚類，并與數據庫對比，進行物種注釋；基于OTU和注釋結果進行樣品Alpha多樣性、Beta多樣性、腸道菌群構成差異性分析等一系列的綜合性分析及處理。

2 結果

2.1 各組患者OTU聚類和物種注釋結果分析對照組、非濕熱證組、濕熱證組的腸道菌群物種豐富程度不同，OTU種類分別為45 174種、67 511種和 59 314 種，特有OTU種類分別為187 575種、34 621種和30 179種。代償期乙型肝炎肝硬化患者OTU種類多于對照組，獨有OTU種類也增多；濕熱證組較非濕熱證組的OTU種類以及每組間的獨有OTU種類減少，見圖1。

2.2 各組患者Alpha多樣性分析Alpha多樣性是對單個樣本中物種多樣性分析，結果顯示，濕熱組與非濕熱組Good-coverage指數較對照組升高，且濕熱組與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明三組間腸道菌群的群落豐富度、菌群多樣性有一定差異，見圖2。

注：A：對照組；B：非濕熱證組；C：濕熱證組圖1 各組患者OTU聚類Venn圖

注：A：對照組；B：非濕熱證組；C：濕熱證組圖2 各組患者Alpha多樣性分析

2.3 各組患者Beta多樣性分析Beta多樣性分析映樣本群落組成的相似性。主坐標分析(Principal Co-ordinates Analysis，PCoA)結果顯示，對照組及非濕熱證組組間樣本坐標出現聚攏，表明二組內菌群結構相似，而濕熱證組菌群結構差異性大，與其他兩組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明濕熱證在一定程度上改變了代償期乙型肝炎肝硬化患者的腸道菌群，見圖3。

2.4 腸道菌群構成及差異性分析

2.4.1 各組患者腸道菌群在門水平的物種組成豐度分析 在門水平中，檢測出主要菌門9個，分別為：厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)。其中，放線菌門相對豐度值在對照組、非濕熱證組、濕熱證組三組間逐漸增高，且濕熱證組與其他比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；濕熱證組綠菌門相對非濕熱證組豐度值明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；濕熱證組酸桿菌門相對其他兩組豐度值均明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

注：A：對照組；B：非濕熱證組；C：濕熱證組圖3 各組患者Beta多樣性分析

注：A：對照組；B：非濕熱證組；C：濕熱證組圖4 各組患者腸道菌群在門水平的物種組成豐度分析

2.4.2 各組患者腸道菌群在屬水平的物種組成豐度分析 在屬水平中，共檢測出差異性菌屬9種，分別為擬桿菌屬(Bacteroides)、巨單胞菌屬(Megamonas)、Faecalibacterium、Escherichia-Shigella、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、Subdoligranulum、Blautia、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、羅斯氏菌屬(Roseburia)、Agathobacter。其中，濕熱證組巨單胞菌屬相對其他兩組豐度值均明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；雙歧桿菌屬相對豐度值在健康對照、非濕熱證、濕熱證3組間逐漸增高，且濕熱證組與其他兩組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；濕熱證組乳酸桿菌屬相對其他兩組豐度值增多，且非濕熱組與濕熱組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

2.4.3 各組患者腸道菌群LefSe分析 LefSe(LDA Effect Size)是一種用于發(fā)現高維生物標識和揭示基因組特征的算法，能根據分類學組成對樣本按照不同的分組條件進行線型判別分析，以便找出對樣本劃分產生顯著性差異影響的群落或物種。該分析結果提示，濕熱證組的差異性菌群主要分布在乳桿菌目(Lactobacillales)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、Alistipes、Rikenellaceae。非濕熱組組的差異性菌群主要分布在普雷沃菌科(Prevotellaceae)、韋榮氏球菌屬(Veillonella)、巴恩斯氏菌屬(Barnesiella)、Lachnoclostridium。見圖6。

注：A：對照組；B：非濕熱證組；C：濕熱證組圖5 各組患者腸道菌群在屬水平的物種組成豐度分析

注：A：對照組；B：非濕熱證組；C：濕熱證組圖6 各組患者腸道菌群LefSe分析

3 討論

健康的腸道菌群和完整的腸道屏障對保持腸-肝軸的動態(tài)平衡具有非常關鍵的作用[12]。研究表明，肝硬化患者常存在不同程度的腸道菌群失調和免疫狀態(tài)紊亂，其能促使細菌產物激活免疫系統(tǒng)并加重肝臟炎癥反應，且與肝功能狀態(tài)、Child-Pugh分級密切相關，可誘導和促進乙肝肝硬化并發(fā)癥的產生[13-15]。同時，內毒素、脂肪酸和膽汁酸等與腸道菌群的相互作用和影響也會加重腸黏膜損傷，破壞腸道微生態(tài)平衡和屏障功能[16-18]。因此，乙肝肝硬化的發(fā)生發(fā)展往往與腸道菌群結構改變相互促進、互為因果。

中醫(yī)學理論強調陰陽交感、對立制約、互根互用和消長平衡，注重五行相生、相克，這恰好與腸道菌群各種微生物之間彼此制約，互相依存而形成動態(tài)的生態(tài)平衡非常相似[5]。中醫(yī)以“整體觀念”和“辨證論治”為核心，以證候反映當前階段疾病本質(狀態(tài))。從臨床表現看，肝硬化濕熱證患者常見脘腹脹滿，乏力納呆，口干苦，肛門灼熱，大便黏膩不爽，或見泄瀉、里急后重等，其與腸道菌群紊亂引起的消化道癥狀存在高度的一致性。中醫(yī)學認為，肝脾氣機不暢，運化失常，水濕痰飲內生，郁久則易釀生濕熱，而濕熱作為病理產物，蘊蒸肝膽或中焦，致使腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，條件致病菌異常增殖，腸道菌群代謝功能紊亂，并通過炎癥反應介導加速肝臟損傷，大量臨床基礎研究亦證實，炎癥是濕熱證的重要病理物質基礎[19-21]。

本研究通過對乙型肝炎肝硬化不同中醫(yī)證候患者及對照組的腸道菌群結構進行對比分析發(fā)現，濕熱證組腸道菌群與非濕熱證組和對照組比較，無論是菌群多樣性還是物種豐富程度，均有一定程度變化。濕熱證與代償期乙型肝炎肝硬化患者的某些腸道菌群的豐度變化相關，主要表現為濕熱證組放線菌門、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬相對豐度值增高，綠菌門、酸桿菌門、巨單胞菌屬相對其他兩組豐度值均明顯減少。放線菌門因其菌落呈放射狀而得名，為革蘭氏陽性細菌，主要能促使土壤中的動物和植物遺骸腐爛。有研究表明，放線菌門在高脂肪和動物蛋白飲食患者腸道菌群中豐度增加，且與功能性胃腸病的發(fā)病有一定相關性[22]。雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬均為人體內的益生菌，具有抗感染、調節(jié)宿主免疫系統(tǒng)、殺滅病原體等功效。巨單胞菌屬為丁酸鹽產鹽菌，能夠發(fā)酵各種碳水化合物，是腸道能量來源的提供者，并能保護腸道黏膜，提高腸道免疫等。有研究顯示，巨單胞菌在病毒性肝炎、原發(fā)性肝癌患者的糞便菌群中均會出現豐度值的減少，提示其與“腸-肝軸”調控具有一定相關性[23]。綠菌門是一類進行不產氧光合作用的細菌，有研究顯示其會在肝臟損傷修復時被大量消耗[24]。目前，關于酸桿菌門的研究較少，但有報道發(fā)現其在肺纖維化、肝纖維化患者的腸道菌群中出現豐度值降低[25-26]。

綜上所述，代償期乙型肝炎肝硬化患者存在腸道菌群失調，濕熱證腸道菌群物種豐富程度及多樣性與非濕熱證及健康對照人群存在明顯差異。本研究從腸道菌群角度初步揭示代償期乙型肝炎肝硬化濕熱證中醫(yī)證候的生物學基礎，為闡明濕熱與腸道菌群之間的關系提供了客觀依據，同時為中醫(yī)藥有效干預肝硬化濕熱證腸道菌群失調提供了新靶點和新思路。另外，基于中醫(yī)證候研究的復雜性及多態(tài)性，本研究僅對濕熱證患者與其他人群的腸道菌群分布特征進行了差異性分析，對非濕熱證中的常見證如肝郁脾虛、肝腎陰虛等尚未分層對比，同時亦缺乏對證候、理化檢查及腸道菌群之間相互關系的深入系統(tǒng)分析，因此還需在后續(xù)研究中進一步充實與完善。