殘緣璃眼蜱玻片標本硼砂卡紅染色試驗

陸 靜，李琳潔，阿麗雅，高珍珍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

蜱蟲和蚊子都屬于節(jié)肢動物，在分類學上蜱蟲被列為蜱螨目下的蜱亞目，最后歸屬于蜱總科，蜱科又分為三個科，分別是納蜱科、軟蜱科和硬蜱科[1-2]。硬蜱類的蜱蟲是最常見且對人和家畜危害性最大的一類[3-4]。 殘緣璃眼蜱（Hyalomma detritum），硬蜱科璃眼蜱屬的一種蜱蟲，國內(nèi)主要分布在黑龍江、吉林、遼寧和內(nèi)蒙古等省、自治區(qū)[5-6]。現(xiàn)階段最普遍的蜱種分類方式是運用顯微鏡和解剖鏡對其進行形態(tài)學鑒定，找到蜱蟲最具特征性部位與《中國經(jīng)濟昆蟲志》比對，來確定被檢蜱蟲的種類。目前，參考資料里用于區(qū)分不同蜱蟲具有特征性的部位包括假頭基、須肢、生殖孔、肛溝、盾板、孔區(qū)、足基節(jié)和氣門板等，然后根據(jù)其有無、形狀的不同、大小、長短和位置等來進行判別[7-8]。本試驗探索研究了殘緣璃眼蜱玻片標本硼砂卡紅染色方法，建立了一種快速、簡單、方便，標本清晰度高、對比性強、狀態(tài)易于識別的染色條件，為制作高質量的殘緣璃眼蜱玻片標本提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所需殘緣璃眼蜱蟲體，取自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院寄生蟲標本室保存的標本。

1.2 試劑和儀器

蓋玻片、載玻片、量筒、染色缸、三角瓶、挑蟲針、研缽、中性樹膠、丁香油、硼砂、卡紅、乙醇、福爾馬林和氫氧化鈉，其中試劑均為國產(chǎn)分析純。

顯微鏡（蔡司遠東有限公司，PRIMOSTAR）、水浴鍋（金壇市鑫鑫實驗儀器有限公司，HH-1）、恒溫培養(yǎng)箱 （上海一恒科學儀器有限公司，DHP-9011）、天平（上海佑科儀器儀表有限公司，YP5002）。

1.3 試劑配制

硼砂卡紅染色液配制：將硼砂研磨后，制備成4%的硼砂水溶液，取100 mL該溶液加入1g研磨充分的卡紅，并在水浴鍋中加熱至卡紅完全溶解后，再加入100 mL70%的乙醇，靜置24 h后，將硼砂卡紅染色液過濾后放入棕色瓶中備用。

1%酸酒精配制：將1 mL的鹽酸溶于99 mL70%乙醇中。

巴氏液配制：將8 g Nacl溶于30 mL福爾馬林中，加蒸餾水至1000 mL。

1.4 玻片標本制作方法

蟲體前處理：將10%的NaOH水溶液煮沸數(shù)分鐘。對于較大的蟲體，需要用昆蟲針在蟲體上刺些小孔，以利于蟲體內(nèi)部組織的溶出，將蟲體置于溶液中，加熱直至蟲體內(nèi)部的肌肉和內(nèi)臟被溶解排出，蟲體軟化透明為止。取出蟲體置于清水中洗去堿液。清洗時要注意輕輕壓擠蟲體，使內(nèi)容物排凈或把蟲體置于吸水紙上，輕輕壓擠，使內(nèi)容物排出后被吸水紙吸附，再將蟲體置于清水中清洗。

染色：將清洗好的蟲體分別置于100%硼砂卡紅染液、90%硼砂卡紅染液、80%硼砂卡紅染液、70%硼砂卡紅染液、60%硼砂卡紅染液和50%硼砂卡紅染液中24 h。

脫水：染色后的蟲體在30%、40%、50%、60%和70%的乙醇中各脫水45 min，移入酸酒精中脫色30 s，取出蟲體放入70%乙醇中沖洗，洗去蟲體周圍浮色，然后將蟲體移入各級乙醇（80%、90%、95%、100%）中繼續(xù)脫水1 h。

透明：將無水乙醇中的蟲體挑出后，移入無水乙醇和丁香油原液比例為1:1的透明液中透明30 min，再用丁香油原液透明1 h。

封片：用挑蟲針輕輕挑取透明后的蟲體放在已洗凈的載玻片上，距離磨砂面約2.5 cm處，用挑蟲針調整蟲體位置，然后在蟲體處滴加適量中性樹膠，用蓋玻片封片，將制備好的玻片平放在載玻片架上，將其放入37℃溫箱中直至排凈氣泡，取出后室溫陰干。

2 結果

100%硼砂卡紅染液 （圖1）、90%硼砂卡紅染液（圖2）、80%硼砂卡紅染液（圖3、圖4）、70%硼砂卡紅染液（圖5）、60%硼砂卡紅染液（圖6）、50%硼砂卡紅染液（圖7）和不染色（圖8）。試驗結果顯示，經(jīng)80%硼砂卡紅染液染色過夜，制作殘緣璃眼蜱玻片標本結構清晰，顏色鮮亮，染色后蟲體整體為粉紅色，假頭和軀體界限分明。

圖1 100%硼砂卡紅染液（40×）

圖2 90%硼砂卡紅染液（40×）

圖3 80%硼砂卡紅染液（40×）

圖4 80%硼砂卡紅染液

圖5 70%硼砂卡紅染液（40×）

圖6 60%硼砂卡紅染液（40×）

圖7 50%硼砂卡紅染液（40×）

圖8 蟲體不染色（40×）

經(jīng)80%硼砂卡紅染液染色后，假頭和軀體界限分明,假頭的一對須肢細長由四節(jié)組成，每一節(jié)纖毫畢現(xiàn)；一對螯肢，位于兩腳須之間，呈長桿狀（圖9）。軀體后緣的緣垛凸凹有致（圖10）；四對足，每只足由六節(jié)組成，分別為基節(jié)、轉節(jié)、股節(jié)、脛節(jié)、前跗節(jié)和跗節(jié)（圖11）；足末端的爪和爪墊結構清晰、形態(tài)生動（圖12）；哈氏器位于第一對足的跗節(jié)近端部的背緣上，呈泡腔狀（圖13）；雄蜱腹面的肛門、肛側板和副肛側板，后端的肛下板層次分明；雌蜱氣門板往往呈逗點狀，雄蜱氣門板多為曲頸瓶狀，具有窄而長的背突（圖14）。

圖9 螯肢和腳須（100×）

圖10 緣垛（40×）

圖11 足（40×）

圖12 爪和爪墊（200×）

圖13 哈氏器（100×）

圖14 肛門、肛側板和副肛側板（40×）

3 討論

蜱可傳播多種病原，包括細菌、病毒和原蟲等，其中一些病原具有人獸共患的特點，對人類和畜牧業(yè)生產(chǎn)危害極大。全球共有蜱類3科907種，硬蜱科約700種，軟蜱科約200種，我國已描述定名的有2科10屬125種，其中硬蜱科111種，軟蜱科14種[9]，其分布廣泛，生活習性各異，應根據(jù)不同蜱種的生物學特性，因地制宜，采用相應的防制措施，才能取得良好的效果。一種好的蜱種鑒定方法是有效防制措施的前提。

目前，傳統(tǒng)形態(tài)學的鑒定方法和分子生物學手段都能運用到蜱蟲的鑒定中，但對一些科研條件不允許的地方，傳統(tǒng)形態(tài)學的鑒定方法就顯得十分重要。本試驗通過優(yōu)化蜱蟲硼砂卡紅染液方法，借助解剖鏡觀察,并參考《中國經(jīng)濟昆蟲志》，根據(jù)蜱蟲形態(tài)學的描述對蜱蟲進行鑒定[10]。蜱蟲形態(tài)學鑒定時，將蟲體染色，在染色過程中染液不宜過濃。若提高稀釋倍數(shù)而延長染色時間，染色的效果反而更佳。稀釋染液時，所用液體的含水量盡量與固定液的含水量相同或接近。本次試驗將硼砂卡紅染液原液按80%稀釋，染色24 h后，蟲體染色均勻，結構清晰，顏色鮮亮。

助色基團中具有酸性或堿性基團的染料分別稱為酸性或堿性染色劑0?？t粉末溶解于酸性或堿性溶液中才可以染色，兩種卡紅染液分別為醋酸卡紅染液、硼砂卡紅溶液0，其中以醋酸為溶劑的染液滲透作用快，染色后蟲體結構清晰，染色標本不易褪色，但可能存在染色不均勻的現(xiàn)象；卡紅以硼砂為溶劑進行染色，標本在制作完成后顏色質地均勻，不會出現(xiàn)染色過于濃郁的缺點。

本試驗相較于其他標本的制作方法，其制成的玻片標本可以長期保存且不易褪色；玻片標本攜帶方便，便于老師教學示范；制作方便簡易，不需要密封轉盤、封片機等，有利于條件較差的基層工作者進行診斷鑒定；一次制作，反復使用，解決了教學資源緊缺的問題，節(jié)約試驗材料，且便于學生觀察。殘緣璃眼蜱染色標本的制作方法有很多種，其中卡紅染色方法操作簡單，可重復性高，經(jīng)濟實惠，實用性高；該觀察方法簡便易于實施，且可以滿足研究者的基本觀察需要，尤其是在基層單位實驗條件較差時也可以使用，更利于該方法的推廣，使用更加具有普遍性。

4 結論

經(jīng)80%硼砂卡紅染液染色過夜，制作殘緣璃眼蜱玻片標本結構清晰，顏色鮮亮，染色后蟲體整體為粉紅色，假頭和軀體界限分明，且玻片標本可長時間保存。